【商检行业标准(SN)】 食品中过敏成反检测方法 第2部分:实时荧光PCR法检测花生成分

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1961.2—2007
食品中过敏原成分检测方法
第2部分：实时荧光PCR法检测花生成分Detection of allergen components infood-Part 2:Protocol of the real-time fluorescent PCR for detecting peanut component2007-08-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
数码防伪
2008-03-01实施
SN/T1961食品中过敏原成分检测方法》分为两个部分：第1部分：酶联免疫法检测花生成分；第2部分：实时荧光PCR法检测花生成分。本部分为SN/T1961的第2部分。
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：张霞、高旗利、罗茂凰、郑文杰、张海滨、张海英、黎径。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T1961.2—2007
1范围
食品中过敏原成分检测方法
第2部分：实时荧光PCR法检测花生成分SN/T1961.2-—2007
SN/T1961的本部分规定了食品中过敏原花生成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于检测糕点、糖果、冰淇淋等食品中过敏原花生成分，其他食品可参照使用。2术语、定义和缩略语
2.1术语和定义
下列术语和定义适用于SN/T1961的本部分。2. 1. 1
实时荧光PCRreal-timefluorescentPCR实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR过程，最后通过荧光信号的增幅进行定性分析。2.2缩略语
下列缩略语适用于SN/T1961的本部分。2.2.1Ct值：C：cycle，T：threshold，每个反应管内的荧光信号到达设定的阅值时所经历的循环数PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应，简称PCR。2.2.21
2.2.3DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸。dNTP：deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸。2.2.4
dATP：deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸。2.2.5
dCTP：deoxyeytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸2.2.6
dGTP：deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。dTTP：deoxythymidinetriphosphate，脱氧胸苷三磷酸。dUTP：deoxyuridinetriphosphate，脱氧尿苷三磷酸。2.2.9
UDG：uracilDNAglycosylase，尿嘧啶DNA-糖基化酶。bp:basepair，碱基对。
Tag：Thermusaqualicu，水生栖热菌。Tris：tris（hydroxymethyl）aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。TE：Tris-HCI、EDTA缓冲液。
检测方法
3.1方法提要
食品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板进行实时荧光PCR扩增，检测食品中是否存在过敏原花生成分。
3.2试剂和材料
除另有规定外，试剂为优级纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。3.2.1CTAB缓冲液：55mmol/LCTAB、1400mmol/L氯化钠（NaCI）、20mmol/LEDTA、100mmol/LTris，用10%盐酸（HCl）调pH至8.0121℃，20min高压灭菌，储存于2℃~8℃备用。SN/T1961.2—2007
TE缓冲液：10mmol/LTris、150mmol/L氯化钠（NaCI)、2mmol/LEDTA、1%十二烷基磺酸钠，用10%HCl调pH至8.0，121℃，20min高压灭菌，储存于2℃~8℃备用。3.2.3
蛋白酶K（20mg/mL）。
RNA酶溶液（5μg/μL）。
Tris饱和酚。
酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）：三氯甲烷：异戊醇（24：1）。异丙醇。
70%乙醇。
10mmol/LTris-HCl(pH9.0)
引物：5'-GCAACAGGAGCAACACTTCAACGCTGTGGTGCCCTAAGG-3
探针:5'(FAM)-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG(Eclipse)-3
TaqDNA热启动聚合酶
dNTP:dATP、dTTP.dCT
10XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HClc化镁（MgCl）。
仪器和设备
天平：量程2kg，感量0.1g量程2kg·是实时荧光PCR仪。
冷冻离心机。
3.3.4 pH计。
3.3.5移液器：2μL~10μL、10μL~100μL100μL3.3.6
振荡器。
研钵及粉碎装置。
检测程序
过敏原花生成分实时荧光PCR检测阴性
状样品提取
实时荧光PCR检测
报告结果
mol/L化钾（KCD)、15mmol/L氯
图1过敏原花生成分实时荧光PCR检测程序图3.5步骤
3.5.1制样方法
称取约200g样品，用洁净研钵或合适的粉碎装置将样品粉碎至粉末状。3.5.2模板DNA提取
3.5.2.1CTAB法
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称取300mg已制备好的样品至2mL离心管中，加入600μLCTAB（若样品吸水性强适当增加CTAB加人量）、40μL蛋白酶K，振荡均勾，65℃温育30min；加人500μuL酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1），强烈振荡，12000r/min离心15min；吸取上层水相至1.5mL离心管中，加人等体积异丙醇，振荡均匀，12000r/min离心10min：弃上清液，用预热至65℃TE缓冲液溶解DNA（TE量视DNA沉淀的多少而定）；加入5μLRNA酶溶液，37℃温育30min；加人200μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡，12000r/min离心15min；吸取上层水相至新的1.5mL离心管中，加人等体积异丙醇，振荡均匀，12000r/min离心10min；弃上清液，加人70%乙醇小心清洗沉淀DNA，12000r/min离心1min；弃上清液，干燥，加预热至65℃TE缓冲液溶解DNA。每个样品做两个平行样，同时设立试剂提取对照（以水代替样品）。3.5.2.2商品化试剂盒方法
商品化基因组提取试剂盒，使用时按照操作说明书进行操作。3.5.2.3所提取样品DNA的质量评估样品中提取的DNA用紫外分光光度法检测，分别计算核酸的纯度及浓度，计算见式（1）、式（2）：DNA纯度=ODz60mm/OD28Dmm
比值在1.7～2.0之间较好，符合PCR检测要求。3.5.3实时荧光PCR扩增
3.5.3.1反应体系
双链DNA浓度（μg/mL）=50×OD2a0m（1)bzxz.net
10×PCR缓冲液5μL，引物对（10μmol/L）各2μL、探针（10μmol/μL)1.5μL、dNTP（10mmol/L）1μL、TagDNA热启动聚合酶（5U/μL)0.5μL、模板DNA0.1μg~2pg、补水至50uL。3.5.3.2反应参数
预变性95℃10min，1个循环：95℃15s.60℃1min，同时收集FAM荧光，进行45个循环。3.5.4质控设置
进行检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照、提取对照。3.5.4.1阳性对照
以花生DNA为模板或采用含有扩增片段（花生Arah2基因序列）的质粒DNA作为模板。3.5.4.2阴性对照
采用非花生成分的DNA作为模板。3.5.4.3提取对照
采用试剂提取对照作为模板。
结果分析及判定
4.1基线的设置
实时荧光PCR反应结束后进行结果分析时，应设置基线范围。基线范围选择一般在6个～15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阀值设置原则以值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准。1）不同仪器、不同TagDNA热启动聚合酶可根据要求将反应参数做适当调整。SN/T 1961.2—2007
4.2质控标准
阴性对照：无荧光增幅现象。
提取对照：无荧光增幅现象。
阳性对照：Ct值≤30.0，并且曲线有明显的荧光增幅现象。以上指标有一项不符合均视为此次实验无效若阴性对照或提取对照出现荧光增幅现象，说明在样品提取或反应体系中存在污染，可能出现检测结果假阳性。阳性对照结果无荧光增幅现象，说明反应体系存在问题，检测可能出现假阴性结果。根据对照结果分析问题，重新检测样品。4.3结果判定
检测样品无荧光增幅现象，并且阳性对照、阴性对照、提取对照结果正常者，可判定该样品中未检出过敏原花生成分。
检测样品Ct值≤40.0，曲线有明显的荧光增幅现象，并且阳性对照、阴性对照、提取对照结果正常者，可判定该样品中检出过敏原花生成分。检测样品Ct值在40.0～45.0之间，应重做实时荧光PCR反应。再次扩增后的结果Ct值仍在40.045.0之间，并且阳性对照、阴性对照、提取对照结果正常者，可判定样品中检出过敏原花生成分，否则判定该样品中未检出过敏原花生成分。两个平行样中只要有一个样品检测为阳性，即可判定该样品中检出过敏原花生成分。书号：155066·2-18243
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