【国家标准(GB)】 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定

ICS67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.23—2006
代替GB/T5009.23—2003
食品中黄曲霉毒素B1、B2G1、G2 的测定Determination of aflatoxins B,,B2,G,,G2 in foods2006-09-14发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
数码防伪
2007-01-01实施
本标准代替GB/T5009.23—2003《食品中黄曲霉毒素B、B2、G1、G的测定》本标推与GB/T5009.23—2003相比主要变化如下：-增加了第三法，即高效液相色谱测定方法。GB/T5009.23-2006
第三法对应于国际分析家协会（AOAC)AOACOfficialMethod994.08方法《用多功能柱检测玉“米、杏仁、巴西坚果、花生和阿月浑子果中黄曲霉毒素的方法》［AflatoxinsinCorn，Almonds，BrazilNuts,Peanuts，andPistachioNuts-Multifunctional Column（Mycosep）Method]。本标准与AOACOfficialMethod994.08的一致性程度为非等效。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准第一法由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、中华人民共和国青岛进出口商品检验局负责起草。
本标准第二法由北京市卫生防疫站、中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、卫生部食品卫生监督检验所负责起草。
本标准第三法由中国疾病预防控制中心营养与食品安全所负责起草；山东省疾病预防控制中心、宁波市疾病预防控制中心、厦门市疾病预防控制中心参加起草。本标准第三法主要起草人：刘秀梅、王君、李凤琴、计融、陈金东、姚浔平、骆和东、张宏元。本标准于1985年首次发布，1996年第一次修订，2003年第二次修订，本次为第三次修订。1范围
食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定本标准规定了各种食品中黄曲霉毒素B、B2、G1、G2的测定方法。GB/T5009.23—2006
本标准的第一法、第二法适用于各种食品中黄曲霉毒素B1、B2G1、G?的测定，第三法适用于大米、玉米、花生、杏仁、核桃、松子等食品中黄曲霉毒素B、B、G1、G2的测定。本标准第一法和第二法的最低检出量：黄曲霉毒素B、G为0.004μg，Bz、Gz为0.002μg；最低检出浓度：黄曲霉毒素B、G为5μg/kg，BzGz为2.5μg/kg。第三法中黄曲霉毒素的检出限：Bl.G为0.50μg/L，B、G2为0.125ug/L，相当于样品中的浓度：B、G为0.20μg/kg，Bz、G2为：0.05μg/kg。黄曲霉毒素的线性范围：B、G为0.50μg/L～100.0μg/LBzG为0.125μg/L~25.0μg/L2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注甘期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T5009.22—2003食品中黄曲霉毒素B的测定第一法薄层色谱法
3原理
试样经提取、浓缩、薄层分离后，在365nm紫外光下，黄曲毒素B、Bz产生蓝紫色荧光，黄曲霉毒素G1、G产生黄绿色荧光，根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量来定量。4试剂
4.1同GB/T5009.22--2003中3.1~3.13。4.2次氯酸钠溶液（消毒用）：配制方法见GB/T5009.22一2003中3.16。4.3苯-乙醇-水（46+35+19）展开剂：取此比例配制的溶液置于分液漏斗中，振摇5min，静置过夜将上下层溶液分别置于具塞瓶中保存，上下层交界的溶液弃去不要。若溶液出现混浊，则在80℃水浴上加热，待清晰后，即停正加热，取上层溶液作展开剂用。另取一定量的下层溶液置小血中，再放于展开槽内。将薄层板放人展开槽内，预先饱和10min后展开。4.4硫酸（1十3）。
4.5黄曲霉毒素B、Bz、G,G2标准溶液如下：4.5.1单一标准溶液（10μg/mL）：准确称取黄曲霉毒素B、G标准品各1mg~1.2mg，黄曲霉毒素BzG标准品各0.5mg~0.6mg，用苯-乙混合液作溶剂。配制方法、浓度及纯度的测定参照GB/T5009.22—2003中3.14。
黄曲霉毒索B、B2、G、G2的分子质量及用苯-乙腈作溶剂时的最大吸收峰的波长及摩尔消光系数见表1。
GB/T5009.23—2006
黄曲霉毒素的分子质量、最大吸收峰波长及摩尔消光系数表1
黄曲霉毒素名称
最大吸收峰波长/nm
摩尔消光系数
各标准使用液：以下各标准液均用苯-乙腈混合液配制。4.5.2
分子质量
黄曲霉毒素混合标准使用液I：每毫升相当于0.2g黄曲霉毒素B、G及0.1μg黄曲霉毒4.5.2.1
素B2、G2,作定位用。
4.5.2.2黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ：每毫升相当于0.04μg黄曲霉毒素Bi、G，及0.02μg黄曲霉毒素B、G2,作最低检出量用。5仪器
同GB/T5009.22—2003中4.1~4.9。6分析步骤
6.1取样
同GB/T5009.22—2003中5.1。
6.2提取
同GB/T5009.22—2003中5.2。
6.3测定
6.3.1单向展开法
6.3.1.1薄层板的制备
同GB/T5009.22—2003中5.3.1.1。6.3.1.2点样
同GB/T5009.22-—2003中5.3.1.2。滴加式样如下：第一点：10uL黄曲需毒素混合标准使用液ⅡI。第二点：20μL样液。
第三点：20μL样液+10μL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ。第四点：20μL样液+10μL黄曲霉毒素混合标准使用液I。6.3.1.3展开与观察
黄曲霉毒素B1、Bz、G、G,的比移值依次排列为B>B,>G,>Gz。在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm，取出挥干，再于另一展开槽内加10mL丙酮-三氯甲烷（8十92），展开10cm～12cm，取出。在紫外光灯下观察结果，方法如下。6.3.1.3.1由于样液点上加滴黄曲霉毒素混合标准使用液I或Ⅱ，可使黄曲霉毒素B、Bz、GIG2分别与样液中的黄曲霉毒素B、Bz、GI、G.荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B、B2、G、G2依次为0.0004μg.0.0002μg、0.0004μg、0.0002ug，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B1、B,、G、G的最低检出量是否正常出现。如为阳性，则起定位作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B、B2、G、G.依次为0.002μg、0.001μg、0.002ug、0.001μg，主要起定位作用。6.3.1.3.2若第二点在与黄曲霉毒素B、B的相应位置上无蓝紫色荧光点；或在与黄曲霉毒素G1、G的相应位置上无黄绿色荧光点，表示试样中黄曲霍毒素B、Gl含量在5μg/kg以下；B2、G2含量在2.5ug/kg以下；如在相应位置上有以上荧光点，则需进行确证试验。2
6.3.1.4确证试验
GB/T5009.23—2006
6.3.1.4.1黄曲霉毒素与三氟乙酸反应产生衍生物，只限于B，和GB2和G2与三氟乙酸不起反应。B,和G，的衍生物比移值为B,>G1。于薄层板左边依次滴加两个点。第一点：10μL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ。第二点：20μL样液。
于以上两点各加三氟乙酸1小滴盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min，使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃。再于薄层板上滴加以下两个点。第三点：10μL黄曲毒素混合标准使用液Ⅱ。第四点：20μL样液。
再展开（同6.3.1.3），在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B，或G，标准点相同的衍生物，未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。6.3.1.4.2黄曲霉毒素B，和G2的确证试验，可用苯-乙醇-水（46十35十+19）展开，若标准点与样液点出现重叠，即可确定。
6.3.1.4.3在展开的薄层板上喷以硫酸（1+3)，黄曲毒素B、B2、G1、G2都变为黄色荧光。6.3.1.5稀释定量
样液中黄曲霉毒素BI、Bz、G1、Gz荧光点的荧光强度如各与黄霉毒素B1、B2、G1、Gz标准点的最低检出量（B、G为0.0004μg,Bz、Gz为0.0002ug)的荧光强度一致，则试样中黄曲霉毒素B、G含量为5μg/kg；Bz、G2含量为2.5ug/kg。如样液中任何一种黄曲霉毒素的荧光强度比其最低检出量强，则需逐一进行定量，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。定量与计算方法参照GB/T5009.22—2003中5.3.1.5与5.3.1.6。6.3.2双向展开法
6.3.2.1滴加两点法
6.3.2.1.1点样：取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加黄曲霉毒素标准使用液与样液。即在三块板的距左边缘0.8cm～1cm处各滴加10μL黄曲需毒素混合标准使用液I，在距左边缘2.8cm~3.0cm处各滴加20μL样液，然后在第二板的样液点上加滴10μL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ；在第三板上的样液点上加滴10uL黄曲霉毒素混合标准使用液I。6.3.2.1.2展开：同GB/T5009.22--2003中5.3.2.1.2。6.3.2.1.3观察及评定结果如下：6.3.2.1.3.1在紫外光灯下观察第一、二板，若第二板的第二点在黄曲霉毒素Bt、B2、G、Gz标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的相同位置上未出现荧光点，则试样中黄曲霉毒素BI、G含量在5μg/kg以下；BzGz的含量在2.5μg/kg以下。6.3.2.1.3.2若第一板在与第二板的相同位置上各出现荧光点，则将第一板与第三板比较，看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置的荧光点是否各与其黄曲霉毒素B、B2、G1、Gz标准点重叠，如果重叠，再按6.3.2.1.3.3进行所需的确证试验。6.3.2.1.3.3黄曲霉毒索B、G的确证试验：取薄层板两块，于第四、第五两板距左边缘0.8cm～1cm处各滴加10μL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ及1滴三氟乙酸，距左边缘2.8cm~3cm处，第四板滴加20μL样液及1滴三氟乙酸；第五板滴加20μL样液、10μL黄曲霉毒素混合标准使用液Ⅱ及1滴三氟乙酸。产生衍生物的步骤及展开方法同GB/T5009.22一2003中5.3.2.1，观察样液点是否各产生与其黄曲需毒素B或G标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。如样液黄曲霉毒素B、Bz、G、G2含量高时，则将样液稀释后按6.3.1.4作确证试验。稀释定量与结果计算参照GB/T5009.22—2003中5.3.2.1.5与5.3.2.1.6。6.3.2.2滴加一点法
同GB/T5009.22—2003中5.3.2.2。所不同的地方是在薄层上滴加标准液时以黄曲霉毒素混合3
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标准使用液Ⅱ代替黄曲霉毒素B标准使用液（0.04μg/mL）。稀释定量与结果计算参照GB/T5009.22—2003中5.3.2.2与5.3.1.6。第二法微柱筛选法
7原理
试样提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱层析管，杂质被氧化铝吸附，黄曲霉毒素被硅镁吸附剂吸附，在365nm紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正比，由于微柱不能分离B、Bz、GI、G2，故结果为黄曲霉毒素的总量。8试剂
8.1石油醚：沸程60℃～90℃或30℃～60℃。8.2中性氧化铝：层析用100目～200日。8.3酸性氧化铝：层析用100目～200目。8.4无水硫酸钠：过40目～80目筛或80目～100目筛。8.5硅镁型吸附剂：层析用100目～200目。甲醇水溶液：（55十45）。
8.7展开剂：丙酮-三氯甲烷（1十9）。8.8脱脂棉：用索氏提取器以二氮甲烷为溶剂提取2h后，挥干后贮于瓶中保存。8.9黄曲霉毒索B,标准液：用苯-乙睛（98+2)配成0.4μg/mL的贮存液及0.1μg/mL的使用液，避光冷藏。
注：层析用氧化铝、硅镁型吸附剂、无水硫酸钠应在120℃活化2h，密塞，贮干燥器内可保存一周。9仪器
9.1紫外光灯：8W~100W，带有波长365nm滤光片。9.2微柱管：内径0.4cm、长12cm的玻璃管，为加液方便上加一段粗管。9.3微柱管架。
9.4微量注射器：50mL。
分析步骤
10.1提取
10.1.1粮食、花生及其制品：取粉碎过筛（20目）试样20.00g于具塞锥形瓶中，加100mL甲醇水溶液，30mL石油醚，密塞振摇30min，静置片刻，过滤于50mL具塞量筒中，收集50mL甲醇水滤液（注意切勿将石油醚层带入滤液中），转人分液漏斗中，加50mL硫酸钠溶液（20g/L）稀释，加三氯甲烷10mL，轻摇2min3min，静置分层，三氯甲烷层通过装有5g无水硫酸钠的小漏斗脱水（以少量脱脂棉球塞住漏斗颈口，并以少量三氟甲烷润湿），并滤人10mL比色管中，再向分液漏斗中加3mL三氯甲烷重提一次，脱水后滤人原比色管中，以少量三氯甲烷洗漏斗并定容至10.0mL，密塞，混匀，待测。此样液1mL相当1.0g试样。
10.1.2植物油：称混勾油样10.00g于20mL的烧杯中，用50mL石油醚分数次洗入分液漏斗中，加50mL甲醇水轻摇2min~3min，静置分层，将下层甲醇水转人另一分液漏斗中，加50mL硫酸钠水溶液（20g/L）稀释，加三氯甲烷10mL，以下按10.1.1自“轻摇2min~3min**..”起操作。此样液1mLA
相当1.0g试样。
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10.1.3发酵酒、酱油、醋等水溶性试样：啤酒等含二氧化碳的试样，需在烧杯中于水浴上加热、搅拌、除去气泡，否则易乳化。称混勾试样20.00g于小烧杯中，以80mL.硫酸钠溶液（20g/L）洗人分液漏斗中，加三氯甲烷10mL，此样液1mL相当2.0g试样。10.1.4腐乳、黄酱类：称取混匀试样20.00g于具塞锥形瓶中，加甲醇水100mL，石油醚20mL。振荡30min，静置片刻，以折叠快速定性滤纸过滤于50mL具塞量筒中，收集甲醇水滤液50mL（相当于10g试样，因为10g试样中约含有5mL水），置于分液漏斗中，加人三氯甲烷10mL，以下按10.1.1自轻摇2min～3min...”起操作。此样液1mL相当1.0g试样。10.2测定
10.2.1微柱管的制备：以少量脱脂棉做底用粗铁丝砸实，置于微柱管架上，依次加入高为0.5cm无水硫酸钠（80目100目），0.5cm硅镁型吸附剂，0.5cm无水硫酸钠（80目~100目），1.5cm中性氧化铝，1.5cm酸性氧化铝，3cm无水硫酸钠（40目～80目），顶部以少量脱脂棉堵塞，装试剂时管要垂直，每装一种试剂要适当敲紧，两种试剂之间界面要平齐，柱管要随装随用，以免在空气中吸水活性下降。10.2.2微柱层析：在装好的微柱中，加人三氯甲烷提取液1.0mL，同时做标准管，另取三支微柱管，各加入三氯甲烷1mL，再分别加人黄曲霉毒素B，标准液(0.1μg/mL)0、50μL、100μL，相当于黄曲霉毒索B，标准0ng、5ng、10ng，待加液流至顶层时，即加人1mL丙酮-三氯甲烷（1十9）展开剂，在加样或展开时，柱管均要保持垂直，待展开剂流完后，即可观察结果。10.2.3结果观察与评定：于波长365nm紫外光灯下观察，将层析后的样品管依次与0ng、5ng、10ng黄曲霉毒素B标准管比较，若试样柱管内硅镁型吸附剂层与0管一致则为阴性（在5g/kg以下），如试样管中硅镁吸附剂层呈蓝紫色荧光环，则为阳性，并需进一步按薄层层析法进行确证测定，但不需重新提取试样。其操作如下：准确吸取原三氯甲烷提取液4.0mL（相当4g或8g试样）于小蒸发皿内挥干，以少量苯-乙腈混合液（98十2)分数次转人刻度小管中，定容至1.0mL，密塞，混匀，按薄层层析法确证,并测定黄曲霉毒素BI、Bz、G1、G2的含量。第三法高效液相色谱法
11原理
试样经乙腈-水提取，提取液过滤后，经装有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱，去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液中的黄曲霉毒素以三氟乙酸衍生，用带有荧光检测器的液相色谱系统分析，外标法定量。
12试剂和材料
12.1黄曲霉毒索BI、B2、GI、Gz标准品，纯度>99%。12.2乙腈，色谱纯、分析纯。
12.3三氟乙酸，分析纯。
12.4正已烷，分析纯。
12.5水，电导率（25℃）≤0.01mS/m。12.6乙腈-水（84+16）提取液：量取乙睛（分析纯）840mL，加水160mL，混匀。12.7水-乙（85+15）溶液：最取乙腈（色谱纯）150mL，加三蒸水850mL，混匀。12.8标准储备液：分别准确称取黄曲霉毒素Bl、B2、Gl、Gz0.2000g、0.0500g、0.2000g、0.0500g（精确至0.001g），置10mL容量瓶中，加乙腈（分析纯）溶解，并稀释至刻度。此溶液密封后避光一30℃保存，两年有效。
12.9标准工作液：准确移取标准储备液1.00μL，至10mL容量瓶中，加乙（分析纯）稀释至刻度。5
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此溶液密封后避光4℃保存，三个月有效。12.10标准系列溶液：准确移取标准工作液适量，至10mL容量瓶中，加乙（分析纯）稀释至刻度（含黄曲霉毒素B、G的浓度为0.00μg/L、0.5000μg/L、1.000μg/L、2.000μg/L、5.000μg/L、10.00μg/L、25.00μg/L、50.00μg/L、100.0μg/L；黄曲霉毒素Bz、G2的浓度为0.00μg/L、0.1250μg/L、0.2500μg/L、0.5000μg/L、1.250μg/L、2.500μg/L、6.250μg/L、12.50μg/L、25.00μg/L的系列标准溶液），注意避光。13仪器和设备
13.1液相色谱系统（HPLC)：附荧光检测器。13.2色谱柱：反相Cis柱，要求4种毒素的峰能够达到基线分离。13.3含有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱：MycosepTM226MFC柱或MycosepTM228MFC柱”。13.4电动振荡器。
13.5漩涡混合器。
13.6烘干箱。
13.7离心机。
13.8真空吹干机，或氮气及水浴锅。13.9天平：感量为万分之一。
14分析步骤
14.1试样提取
称取20g经充分粉碎过的试样至250mL的三角瓶中，加入80mL乙睛-水（84+16）提取液，在电动振荡器上振荡30min后，定性滤纸过滤，收集滤液。14.2试样净化
移取约8mL提取液至多功能净化柱的玻璃管内，将多功能净化柱的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管，净化液就被收集到多功能净化柱的收集池中。14.3试样衍生化
从多功能净化柱的收集池内转移2mL净化液到棕色具塞小瓶中，在真空吹干机下60℃士1℃吹干（或在60℃水浴下氮气吹干，注意不要使液体鼓泡、飞溅）。加人200μL正已烷和100uL三氟乙酸，密闭混匀30s后，在40℃土1℃烘干箱中衍生15min。室温真空吹干机吹干（或室温水浴下氮气吹干），以200μL水-乙腈（85+15）溶解，混勾30s，1000r/min离心15min，取上清液至液相色谱仪的样品瓶中，供测定用。
14.4标准系列溶液的制备
吸取标准系列溶液各200μL，在真空吹干机下60℃吹干（或在60℃水浴下氮气吹干，注意不要使液体鼓泡、飞溅），衍生化方法同14.3。14.5测定
14.5.1色谱条件
色谱柱：12.5cm×2.1mm，5μm，Cia柱温：30℃。
流动相：乙（色谱纯），水，梯度洗脱的变化可参考表2。调整洗脱梯度，使4种黄曲霉毒素的保留时间在4min～25min。
1）Mycosep226MFC柱或MycosepTM228MFC柱是由RomerLabs提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。6
时间/min
流速：0.5mL/min。
进样量：25μL。
表2.流动相的梯度变化
乙睛/（%）
荧光检测器：激发波长：360nm；发射波长：440nm。14.5.2测定
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水/（%)
黄曲霉毒素按照G、B、G2、B,的顺序出峰，以标准系列的峰面积对浓度分别绘制每种黄曲霉毒素的标准曲线。试样通过与标准色谱图保留时间的比较确定每一种黄曲霉毒素的峰，根据每种黄曲霉毒素的标准曲线及试样中的峰面积计算试样中各种黄曲霉毒素含量14.6结果计算
按式（1）计算样品中每种黄曲霉毒素的浓度：AxV
式中：
-试样中每种黄曲霉毒素的浓度，单位为微克每千克（μg/kg)；A
试样按外标法在标准曲线中对应的浓度，单位为微克每升(ug/L)；试样提取过程中提取液的体积，单位为毫升（mL）；一试样的取样量，单位为克(g）)；f试样溶液衍生后较衍生前的浓缩倍数。计算结果表示到三位有效数字。15精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差不得超过算术平均值的15%。16黄曲霉毒素的色谱图
当黄曲霉毒素B,、Bz、Gl、Gz含量分别为25.0μg/L、6.25μg/L、25.0ug/L、6.25μg/L时，产生的色谱图见图1,出峰顺序为Gi、B、G2、Bz。%F
FLD1A,Ex=360,Em=440
黄曲霉毒素的色谱图
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