【商检行业标准(SN)】 地中海实蝇检疫鉴定方法 PCR法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2039—2007
地中海实蝇检疫鉴定方法
PCR法
Identification of Mediterranean fruit fly,Ceratitis ca pitata (Wiedemann)-PCRprotocol
2007-12-24发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-07-01实施
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。-TKANiKAca
SN/T2039—2007
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：杨伟东、余道坚、胡学难、康林、陈枝楠、仲建忠、章桂明、徐浪本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准1
1范围
地中海实蝇检疫鉴定方法
PCR法
本标准规定了地中海实蝇常规PCR和SYBRGreen实时荧光PCR鉴定方法。SN/T2039—2007
本标准适用于进境水果、范科蔬菜（包括番范、茄子和辣椒等）及包装物、士壤等的检验检疫中对地中海实蝇卵、幼虫、和成虫的种类鉴定。规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（negISO3696）3缩略语
下列缩略语适用于本标准。
SG-PCRSYBR green real-time PCRSYBRGreen实时荧光PCR。
dNTP deoxyribonucleoside triphosphate脱氧核苷三磷酸。
melting curve analysis
溶解曲线分析。
Taq酶
栖热水生菌DNA聚合酶。
Colcytochromeoxidasel
细胞色素氧化酶I亚基。
Ct threshold cycle
循环阀值。
4原理
实蝇样本（卵、幼虫、或成虫）经过提取总基因组DNA后，利用设计的特异性引物，通过常规PCR和SYBRGreen实时荧光PCR（SG-PCR）技术，特异性扩增地中海实蝇mtDNACOI基因片段（343bp），根据PCR扩增结果（常规PCR通过产物凝胶电泳结果；SG-PCR通过扩增曲线和溶解曲线），1
SN/T2039—2007
判定实蝇标本的种类是否是地中海实蝇。HiiKANiKAca
特异性引物是通过比对地中海实蝇与腊实蝇属中的纳塔尔实蝇、非洲芒果实蝇，按实蝇属中的加勒比按实蝇、墨西哥按实蝇，以及绝大多数果实蝇的mtDNACOI基因片段设计出来的。5仪器
5.1PCR扩增仪
5.2实时荧光PCR仪。
5.3电泳仪。
5.4紫外分光光度计。
凝胶成像系统。
低温冰箱。
冷藏冷冻冰箱。
水浴锅。
离心机。
电子天平。
微量加样器（0.5μL、2μ、10μ、20μ、100μL、200μ、1000μL)。6试剂
实验用水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。2蛋白酶K（20mg/mL）。
6.3RNA消化酶。
EDTA(0.5mol/L.pH8.0)。
TE(pH 8.0)。
1oXLoadingBuffer（电泳上样缓冲液）。Ladder DNA Marker。
琼脂糖。bzxZ.net
DNA染色剂。
昆虫基因组DNA提取试剂盒。
DNA快速纯化/回收试剂盒。
70%和99.99%乙醇。
6.13酚、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇等有机试剂，有机试剂如未有特殊说明均为分析醇。6.14
PCR试剂盒包括10XPCR缓冲液、Mg2+（25mmol/L）、dNTP（2.5mmol/L)]。Taq酶。
52XSYBRGreenMasterMix。
引物(10pmol/μL）。
7检测方法
实蝇标本的前处理
用于分子生物学试验的实蝇样本使用前应长期冷藏在一4℃冰箱。所有实蝇标本在DNA提取之前均要作前处理，卵、幼虫、蛹、成虫或部分组织等实蝇样本要用无菌水冲洗数遍，晾干：干标本、乙醇和福尔马林浸泡的标本先用TE（pH8.0)浸泡处理1h～2h2
7.2实蝇基因组DNA提取
7.2.1试剂盒法
SN/T2039—2007
将实蝇样本移入1.5mL离心管或碾钵中，捣碎或加人液氮碾磨，之后实验步骤根据试剂盒的操作说明书操作。实蝇基因组DNA溶液置一20℃冷冻保存。7.2.2酚-三氯甲烷法
将单头实蝇样本移入1.5mL离心管或碾钵中，捣碎或加人液氮碾磨。加入DNA裂解缓冲液300uL和蛋白酶K20μL（200μg/mL）65℃水浴1h～3h或过夜；加等体积的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1).轻轻颠倒混匀2次.8000r/min离心5min，小心吸取上清液；加入等体积的三氯甲烷-异戊醇（24：1），混勺.8000r/min离心5min，小心吸取上清液；重复此步骤1次～2次，直到在界面上看不到蛋白质；加入2倍体积的无水乙醇或异丙醇，混匀室温或一20℃沉淀0.5h～3h（也可沉淀过夜），13000r/min离心5min~30min，弃上清液：70%或75%的乙醇洗涤沉淀2次~3次，8000r/min适度离心2min，弃上清液；沉淀干燥后加人50μL～200LTE或去离子水溶解，一20℃低温保存。7.3DNA质量检查
实蝇基因组DNA的纯度和浓度检测方法通过紫外分光光度计测定DNA溶液的OD值，DNA纯度=OD260/OD280（1.6≤OD260/OD280≤2.0，比值低于1.6或高于2.0都认为模板纯度不够，前者不能满足PCR扩增时对模板的纯度要求，需用DNA快速纯化/回收试剂盒纯化：后者模板中含有RNA，必要时要用RNA酶消化）；双链DNA浓度=OD28XDNA母液稀释倍数X50ng/μL。7.4常规PCR扩增反应
7.4.1引物
地中海实蝇常规PCR扩增引物序列见表1。引物序列
正向引物
反向引物
CCCA-COIL
CCCA-COIR
反应体系
反应体系见表2。
5'-TCTTCACGATACTTATTATGTTGTT-35'-ACTTGACGTTGAGAAACAAGG-3
常规PCR反应体系
试剂名称
10XPCR缓冲液（不含Mg+）
MgCl,溶液
正向引物和反向引物
Taq酶
DNA模板
双蒸水
1×PCR缓冲液
2mmol/L
0.2mmol/L
各0.2μmol/L
20ng~40ng
扩增片段长度/bp
PCR反应体系终浓度
补足反应总体积到25ul
注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整3
SN/T2039—2007
7.4.3反应条件
94℃/5min.95℃/40s.54℃/30s，72℃/30s，25个循环，72℃延伸5min。7.4.4阴性对照、阳性对照和空白对照的设置-iiKANiKAca
阴性对照以实蝇科其他实蝇种类（如：桔小实蝇）DNA为模板：阳性对照以已知是地中海实蝇的DNA或含有待测基因序列的质粒为PCR模板；空白对照以水代替DNA模板。7.5SYBR-Green实时荧光PCR
7.5.1引物
引物序列同7.4.1。
7.5.2反应体系
SYBRGreen实时荧光PCR反应体系见表3。表3SG-PCR反应体系
试剂名称
2X SYBR Green Master Mix
正向引物和反向引物
DNA模板
双蒸水
反应总体积
10 μL
各0.5μL
加入PCR反应体系的体积/uL
1 μL(20 ng~40 ng)
注：反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。7.5.3反应条件
50℃/2min；95℃/10min；95℃/15s；60℃/1min；40个循环。7.5.4阴性对照、阳性对照和空白对照的设置同7.4.4。
7.6PCR扩增产物的检测
7.6.1凝胶电泳检测
常规PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检查扩增目标片段的大小。取PCR产物5μL加人上样缓冲液1μL，并用DL2000LadderDNAMarker作分子量标记，在含DNA染色剂的1.5%琼脂糖凝胶上电泳30min（90V)，凝胶图像分析仪上检查是否扩增出预期大小的目标片段，拍摄并记录结果。7.6.2SG-PCR检测
7.6.2.1SYBRGreen实时荧光PCR扩增曲线SG-PCR反应中,PCR扩增中收集到的荧光数据由计算机软件自动生成扩增曲线，即△R，对循环数的曲线图，当样品的荧光值与仪器内标ROX染料之差（△R,）超过设定的阈值则认为是阳性反应，Ct值是指荧光值开始达到指数增长时的循环数。7.6.2.2溶解曲线分析
SG-PCR产物的特异性可用溶解曲线分析来确定，实时荧光PCR反应结束后，直接实时荧光PCK仪上再运行Meltingallias程序进行溶解曲线分析，程序的反应步骤：95℃/15s；60℃/20s，在19min59s内温度上升至95℃并维持15s。4
结果判定
8.1常规PCR检测
SN/T2039—2007
琼脂糖凝胶电泳结果待测样品与阳性对照扩增出一条大小为343bp的特异性DNA产物带，阴性对照与空白对照无DNA产物带。上述实验做2个或2个以上重复，结果一致则可判定样品的种类为地中海实蝇，
8.2SG-PCR检测
待测样品和阳性对照Ct值小于等于30，有典型的扩增曲线，溶解曲线有明显的溶解温度：阴性对照和空白对照无Ct值或Ct天于35，无扩增曲线·溶解曲线无明显的溶解温度。上述实验做2个或2个以上重复，结果一致则可判定样品的种类为地中海实蝇，Ct大于30的样品建议调整模板浓度后重做，重做结果无Ct值，无扩增曲线，溶解曲线无明显的溶解温度，可判定样品不是地中海实蝇。5
SN/T 2039-2007
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
地中海实蝇检疫鉴定方法
PCR法
SN/T2039—2007
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
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电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880X1230
2008年3月第一版
-TKANiKAca
—60 /
印张0.75
字数10千字
2008年3月第一次印刷
印数1—2000
书号：155066·2-18513
定价8.00元
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