【农业行业标准(NY)】 棉籽中棉酚旋光体的测定高效液相色谱法

ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1382—2007
棉籽中棉酚旋光体的测定
高效液相色谱法
Determination of Gossypol Enantiomers in Cotton Seed by HPLC2007-06-14发布
中华人民共和国农业部
2007-09-01实施
1范围
棉籽中棉酚旋光体的测定
高效液相色谱法
本标准规定了棉花种子中棉酚旋光体的高效液相色谱测定方法。本方法适用于棉花种子及其相关产品中棉酚旋光体的测定。2规范性引用文件
NY/T1382—2007
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可以使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T6682分析实验用水规格和试验方法（neqISO3696)3原理
使样品中的左旋（-）棉酚和右旋（+）棉酚与L-苯基丙胺醇充分反应后，分别生成（-）棉酚-L-苯基丙胺醇与（+）棉酚-L-苯基丙胺醇。以甲醇/磷酸水溶液为流动相，两种棉酚衍生物在碳十八柱上有不同的保留时间，从而达到分离目的。在254mm处检测，根据色谱峰的保留时间定性，以峰面积外标法定量。4试剂
4.1水，符合GB/T6682二级用水的规定。4.2甲醇，分析纯。
4.3磷酸，分析纯。
4.4三氯甲烷，分析纯。
4.5石油醚（沸程30℃~60℃），分析纯。4.6L-苯基丙氨醇,分析纯。
4.7（-)棉酚、（+）棉酚和消旋（±)棉酚标准品，纯度在99.9%以上。5仪器设备
5.1高效液相色谱仪，配备紫外检测器，自动数据处理仪。5.2小型粉碎机。
5.3超声波清洗器。
5.4分析天平，精度±0.1mg。
5.5微量注射器，10μL。
5.6容量瓶，25mL，100mL等。bzxZ.net
6试样制备
6.1标准样品
用分析天平称取10mg棉酚标样和约20mgL-苯基丙氨醇，用三氯甲烷溶解后定容于100mL容量NY/T1382—2007
瓶中，振荡后室温下避光放置2h以上。用时根据需要稀释至合适的浓度。进样前用0.5um滤膜过滤。6.2棉籽样品
6.2.1样品净化和提取
将棉籽剥壳，棉仁粉碎，过60目筛。称取棉仁粉0.1g～2g（根据棉酚含量多少决定），置具塞三角瓶中，加入20mL石油醚，振荡后放置2h。弃去上清液，加人20mL三氯甲烷，用超声波处理30min，放置过夜。6.2.2棉酚的衍生化反应
称取0.025gL-苯基丙胺醇，用三氯甲烷溶解并定容至25mL容量瓶中。将提取液过滤到25mL容量瓶中，加入适量L-苯基丙胺醇的三氯甲烷溶液（棉酚与L-苯基丙胺醇的摩尔比在1+5左右），用三氯甲烷定容至刻度，混合均勾，室温下避光放置2h以上。进样前用0.5um滤膜过滤。
7色谱条件
分离柱：μBondapakC（30cm×3.9mm）。柱温：室温，约25℃。
流动相：甲醇+水+磷酸=85+15+0.1.使用前用0.45um滤膜过滤并脱气。流速：1mL/min。
检测波长：254nm。
灵敏度：0.1AUFS。
8样品测定
8.1标准样品进样
待系统走出平稳的基线，用微量注射器抽取2uL～10uL标准溶液进样，约4min时第-个峰即（-）棉酚-L-苯基丙胺醇的馏分峰值出现，约6min时第二个峰即（+）棉酚-L-苯基丙胺醇的馏分峰值出现。标准样品8min可走完一个样品。色谱图如图1所示。8.2棉籽样品进样
在平稳基线条件下，用微量注射器抽取2μL10μL测试样品进样。因试验样品中成分复杂，待两个棉酚旋光体的峰出现后，仍需冲洗3min~5min时间。每个样品约需10min～12min，直到系统走出平稳的基线，方能下一次进样。0
峰1为（-)棉酚-L-苯基丙胺醇
峰2为（+)棉酚-L-苯基丙胺醇
图1两种棉酚旋光体的HPLC图谱
9结果计算
9.1根据(1)式和(2)式分别计算试样中(-)棉酚和(+)棉酚的含量。X(-)G=
Ai×m(-)GxV
Ais×mxVi
A2×m(+)G×V
A2s×mXVi
式中：
试样中左旋棉酚的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；-试样中右旋棉酚的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；试样溶液进样中左旋棉酚的峰面积；试样溶液进样中右旋棉酚的峰面积；一标准溶液进样中左旋棉酚的峰面积；-标准溶液进样中右旋棉酚的峰面积；-左旋棉酚标准品的进样质量，单位为纳克（ng）；-右旋棉酚标准品的进样质量，单位为纳克（ng)；试样的质量，单位为克(g)；
-试样溶液总体积，单位为毫升(mL)；试样的进样体积，单位为微升(μuL)；9.2
2测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留一位小数。精密度
两个平行测定的相对偏差不大于10%。NY/T1382—2007
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