【商业行业标准(SB)】 猪肺炎支原体检验方法

ICS 11.220
备索号：24730—2008
中华人民共和国国内贸易行业标准SB/T10463—2008
猪肺炎支原体检验方法
Methods for the detection of mycoplasmal pueumonia of swine2008-07-03发布
中华人民共和国商务部
2008-12-01实施
本标准的附录A为规范性附录。
本标准由中华人民共和国商务部提出并归口本标准由中华人民共和国商务部宰技术鉴定中心负贵起草。本标谁主要起草人，赵志云、金社胜、郑志明。SB/T10463—2008
—范围
猪肺炎支原体检验方法
本标准规定了猪支原体肺炎的检验方法，本标准适用于生猪屠案过程中猪支原体肺炭的实验室检验。2规范性引用文件
SB/T 10463--2008
下列文件中的条款道过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括期误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励报据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标推。GB/T4789.28—2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
mycoplasmal pneamoniaof swinc绪支原体肺炎
由猪肺炎支原体（mycoptasmahyapneumoniae）感染引起猪的一种接触性传染病。以气喘和咳嗽，患猪长期生长缓慢发育不良、肺门淋巴结髓样肿胀，淋巴组织显著增生为特征。4设备和材料
4.1过滤器:300 nm孔径。
4. 2剪刀,镊了，
4.3锥形瓶:1 000 mL.
4.4均质器或炎菌乳钵。
4.5注射器：1mL(只0.1ml.刻度）,5mL（具0.1mL刻度）4.6量篇:250 mL.
4.7 平阻:直径 90 mml。
4.8 试管:16 mmx160 mm。
4.9 吸管:10 mL(,瓦, 0. 1 mL 刻度)。4.10滤纸、漏斗、纱布、棉花、玻璃棒、胶塞。往：以上试验器材，在试验前应灭菌处理。4.11生化培养箱：36℃±1℃。
4.12恒温水浴箱。
高床灭蘭器。
4.14庆氧：（厌氧培养箱）。
4.15载玻片。
4.16酒精灯。
4. 17电子天平:感量0.1 8。
4.18光学显微镜：物镜10×~100×。4. 19 PH 试纸、接种环等。
SB/T 104632008
5培养基和试剂
姬姆萨氏染色液(见附录A)。
5.2瑞氏染色按GB/T4789.28—2003中2.6的方法进行。5.3伊红美蓝染色（见附录A）
5.4Goodwin氏等复合液体培养基（见附录A)。Goodwin氏等复合固体培养基（见附录A）。5.55
5.6Hanks液(见附录A)，
检验程序免费标准bzxz.net
病理组织
病理学检查
肉眼检查组
织病变
结果判断
7检验用病料
肺脏,肺门淋巴结。
8检验步驿
8.1病理学检查
8.1.1肉眼检查
组织触片、
姬姆紫氏来色
显微镜观察
结果判断
被体培养
分离培养
固体培养
姬姆萨氏染色
星微镜观察
结果判断
图1猪肺炭支原体检验程序
肺的病变部位主要见于心叶，尖叶、中间叶及膈叶的前缘。常呈间质性肺炎病变，两衡肺病变大致对称。病变部界限明显，质地坚实，呈胶样浸润半透明状态，切面湿润、平滑，像嫩肉样（即“肉变”)。严重的病例病变部颜色加深，星说紫红色、深紫色或灰白色、灰红色，至后期半透明状态减轻，坚韧度增加，似胰脏组织(即“胰变\)。
肺门和纵瞩淋巴结肿大，品灰自色、水肝。切面湿润稍外翻，边缘有时可见轻度充血。8.1.2触片及染色
检验样品制成触片，自然十燥，用甲醇固定2min～5min，再以pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释20借的姬姆萨氏染色液染色3h，水洗后立即用丙浸一次，然后镜检。2
YKicaOaaiKAca=
8.1.3镜检
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猪脑痰支原体呈紫红色·多数在细胞外，偶见在嗜中性白细胞的胞浆内。星球状,环状,椭圆形或两极形、直杆或弯杆状，单个或群集。8.2分离培养
8. 2. 1 分离
将病肺组织用Hanks液洗去血液和组织碎片，取病肺25g加人到225mLGoodwin等氏复合液体培养基中，用均质器8000r/min～10000r/min均质1min，或用乳加灭菌砂彝碎用灭菌过滤器过滤，去除杂质。
.2.2培养
移取10mL滤液转种F100mLGoodwin等氏复合液体培养基中，置厌氧罐（或厌氧培养箱）中37士1℃，含5%~10%CO：条件下，培养3d~7d观察其产酸和独度情况，培养基由红变黄，呈轻薇混浊。
取培养液划线接种于Goodwin等氏固体培养基平板，置厌氧罐（或厌氧培养箱)中37C士1℃，培养，在固体培养基上生长缓慢，接种培养7d～10d，观察可见圆形隆起，边缘整齐，表面粗糙，中央有赖粒的针尖大小或麟珠状小南落，8.2.3染色
8，2.3.1取液体培养物途片，自綫干燥后火焰固定，姬姆睡氏染色。8.2.3.2取固休培养物涂片，自然于燥后火焰固定，姬姆萨氏染色。8.2.4镜检
8.2.5结乘判定
镜下所见：因本南无细胞壁，为多形态微生物，有环状、丝状、点状、杆状和两极状等。液体培养物徐片，菌体为蓝色、两极浓染的短杆状或返点状，轮廊清晰。固体培养物涂片，菌体为多形性，环状等等，即可判定为猪肺炎支原体菌体。
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A.1姬姆萨染色液
A.1.1成分
姬姆萨
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
试剂和培养基
姬姆萨染料 0. 6 g 于甘油 50 mL 中,55 ℃ ~60 ℃水浴加热 1. 5 h~2 h 后,加甲醇 50 mL,静置1口以上，过滤成姬姆萨染色原液，临染色前每旁升中性蒸瘤水加原液一滴，即成姬姆萨染色液。A.2美蓝伊红染色液
A.2. 1成分
蒸馏水
蒸馏水
高锰酸钾
A.2.2制法
混合溶液
混合溶液
美监水溶液和高链钾水济液混合后，55～60℃水浴30min，过滤。A.30.5%伊红酒精液
A.3.1成分
无水乙醇
A.3.2制法
100 ml
将0.5伊红置玛瑙乳钵中，边研磨边徐徐加人无水乙醇，便伊红完全溶解于无水乙醇中。A.4Goodwi等氏复合液体培养基
A.4.1成分
Hartley氏消化汤（a）
无菌灭活猪血清(b)
灭活0.5光水解乳蛋白Hank's液（e）灭活酵母浸薇（d）
青霉素
酵酸铊
A. 4.2 制法
A.4.2.1Hartley氏消化汤
200 mL
20000单位
0.125 g/1 000 mL
牛心750g用均质器8000r/min～10000r/min均质1min，加蒸馏水1000mL，水浴加热至80℃时，加人0.8%无水碳酸氢钠1250mL,冷却至45℃加入胰提取液25mL,（新鲜猪胰脏去脂肪切4
iiKacaCaaiKAca-
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碎，250g加蒸馏水750mL加无水乙250mL置室温中，常加摇动，第三大用滤纸过滤三氧甲烷25 mL.
将上述混合物,置于恒温箱中 37 ℃6 h或15 3 h,然后加入浓盐敏 20 mL,水浴蒸汽加热1 h,纱布棉花过滤,以 0. 1 mol/I. 氢氧化钠溶液调节 pH 至 8. 0,趁热以滤纸过滤,再校正 pH 至 7. 6,装瓶 121 ℃ 15 min 高压灭菌,备用。A.4.2.2猪血清配制方法
猪血清水浴 56 ℃ 30 min 灭活。A. 4.2.30.5%水解乳蛋白Hanks液配制方法）成分
水解乳蛋白
Hank's液
混合上述成分，溶解后115C10min高压灭案，Hanks液配制
1）原液—(1)
MgsO, - 7H,0
MgCl - 6H.0
按顺序加人到 800 mL双蒸馏水中。2）原液·（2)
CaCl, 2. 8 g溶于 100 mL 双蒸馏水中。以上两液混合，加双然馏水达1000m.划2mI.=氟甲烷，保存于5℃冰箱中，3)原液二(1)
Na.HPO1 ·12H,0
葡萄糖
按顺序加入到800ml双馏水中。
4）原筱二（2)
0.4%酚红液100mI.(0.4酚红液将0.4g酚红骨乳体中，边研磨边徐徐加人0.1mol/L的氢氧化钠11.28 rnL,酚红应完全溶解,置 100 mL量杯中,最后加蒸馏水达 100 mL)将酚红液与葡菊糖等混合液混合，加双蒸水至1000ml.，加人2mL三氯甲烷，保存于5℃备用。
按下方配成Hank's(汉克斯氏)液5
双蒸馏水
混合上述成分，4.08 kg10min灭菌，此被在5℃下可保存一个月。用前以1.4%碳酸氢钠(4.08 kg 10 min灭菌),无菌操作,矫正 pH到7.4(根据需要而定),大约每 20 mL的 Hank*s(汉克斯氏)液加 0. 5 mL 的碳酸氢钠可达 pH 到 7. 4 ,A.4.2.4酵母浸液
121 ℃ 15 min 高压灭菌。
A, 4, 2. 5 青霉素
20000单位。
SB/T10463—2008
6醋酸铊
A, 4.2. 6
0. 125 g/1 000 mE.
A.4.2.73.5%NaHCO 溶液
121℃ 30 min灭菌。
固体培养基
制法：将纯净琼脂按2%溶于水解乳蛋白Hank\s液中高压灭菌，除青霉素外，其他各成分预先放在56℃中，待琼脂冷却至56℃左右将各成分混合，倾注平板。-iiKacaOiaiKAca
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