【医药行业标准(YY)】 细菌内毒素试验方法常规监控与跳批检验

ICS 11. 040. 01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0618—2007
细菌内毒素试验方法
常规监控与跳批检验
Bacterial endotoxins-
Test methodologies,routine monitoring, and alternatives to batch testing2007-07-02发布
国家食品药品蓝督管理局
2008-03-01实施
2规范性引用文件
3术语和定义
无热原标识
单位产品选择
方法选择
8方法学确认
试验方法
10跳批检验
附录A (资料性附录)
附录B(资料性附录）
附录 C(资料性附录)
参考文献
细菌内毒素试验背景信息
试验方法学和常规监控指南
跳批检验指南
YY/T 0618—2007
YY/T0618—2007
本标准修改采用美国国家标准ANSI/AA.MIST72：2002细菌内毒素试验方法常规监控与跳批
检验》，无技术性差异，仪删除了部分不适用的资料性内容。本标准的附录A、附录B和附录心为资料性附录，本标准由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会提出并归口。本标准由国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心起草。本标准主要起草人：由少华、吴平、黄经春、郝树斌。1范围
细菌内毒素试验方法
常规监控与跳批检验
YY/T 0618-2007
本标规定了用于测定医疗器械，组件或原材料的细菌内毒素试验方法的基本谁则注：虽然本标准的范围限定为医疗器概，但本标准规定的要求和给出的指南可能也适用士其他医疗产品：本标推给出的细菌内毒素试验方法包括定性和定最两种力法。木标准不适用于测定细菌内毒素之外的热原。本标准未规定细菌内毒素的可接受水平。注：细菌内毒素可接受水平虚参照适用的标准。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。中华人民共和国药典：二部（2005年版）3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
细菌内毒囊试验bacterialendotoxinstest通过将液体试验样品与鲨试剂混合来测定活性内毒素的试验，以凝胶、浊度，显色或其他确认过的检验方法测定所产生的相应友应。3.2
批 batch(lut)
定数量的原材料、中问产品或成品，预期或声明采用限定的生产T艺制造，其特性和质量均勾致。
chromogenic technique
显色基质法
利用鲨试剂与内毒素相互作用产生的相应显色反应来定量或定性测定内毒紊的试验方法。3.4
control standard endotoxin
内毒素工作标准品
以国家标准品为基准标定的内毒紊制剂。3.5
除热原depyrogenation
确认过的去除或火活内毒素的过程。3.6
内毒素
endetoxin
与革兰氏阴性菌细胞壁相关的高分子复合物,具有人体致热性并与鲨试剂有特异性反应。1
YY/T0618-—2007
内毒素单位（EU）endotoxin（EU)内毒素活性的标准测定单位。
终点（凝胶）endpuint（gelclot）系列稀释液中的最终阳性管。
enhancement
增强作用
非内毒素相关因素导致的细菌内责素试验异常现象，通常由于试验样品的特性所致，使试验反应大于实际内毒素总量。
gel-clottechnicue
凝胶法
利用鲨试剂与内毒素相避集作用来定量或定性测定内毒素的试验方法。3.11
抑制作用
inhibition
泰致的细菌内毒泰试验异常现象，通常由于试验样品的特性所致，使试验反应小非内毒素相关因
于实际内毒素总量
抑制/增强试验
用于测定细菌
强作用的试验。
干扰因子试验
Thibition/enhancementtest
素试验样品美否具有降低试验准确性的作用·印是否对试验系统产生抑制或增interfering factors test
豪试验样品是青真有
用于测定细菌内毒
强作用的试验。
鲨试剂反应性材
于扰试验准确性的作用，即是否对试验系统产生抑制或增LL reactive material
任何非内毒素成分因能激活鲨
内毒素检查用水
凝胶级联
真有潜在
鲁强作用的材料
纯水或其他规定的可用子细菌内毒素试验的溶解液、稀释液和（或)浸提液，必须对试验方法无反应性。
灵敏度（^）lambda（2）
凝胶法中鲨试剂的标示灵敏度，以EU/mL表示，或是显色基质法和浊度法中所使用标准曲线上最低的内毒素浓度。
萱试剂Limulusamebocytelysate从马蹄蟹（美洲鉴或东方鲨）的循环血变形细胞中提取的试剂，与内毒素相互反应产生凝胶，用于细菌内毒素试验测定细菌内毒素水平。3.18
脂多糖lipopolysaccharide
革兰氏阴性细菌的细胞壁成分，典型的脂多糖由类脂A，核心多糖和O-特异性链组成，2
最大有效稀释倍数（MVD）maximumvaliddilation（MVD）与萱试剂灵敏度相关、能检出规定内毒素限值的样品最大稀释倍数。3.20
无热原non-pyrogenie
描述医疗产品不产生发热反应的术语。注：也可用于说明并标示医疗产品内毒素水平低于规定的限值。3.21
产品内毒素限值nroduct endotuxin limit规定的产品最大可接受内毒素水平，低于人体内毒素极限致热剂量。3.22
热原pyrogen
任何能产生发热反应的物质。
致热性Ppyrogenic
描述医疗产品产生发热反应的术语。注：可用于描述医疗产品内毒素水平超过规定的限值。3.24
内舞素家标准品referencestandardendotaxinRsE）《中华人民共和国药典》中规定的自大肠杆菌提取精制而成的内寿素制剂。3.25
内毒素标准系列稀释液standard control scries用于确认内毒素灵敏度的内毒素国家标准品或工作标准品系列稀释被。3.26
试验内毒素限值testendotoxin limit细菌内毒素试验样品浸提液中允许的最高内毒素浓度。注：该限值的计算是用每单位样品浸提所用内毒素检查用水体积除产品内垂素限值即得。3.27
浊度法turhidimetric tcchniqucYY/T0618—2007
利用鲨试剂与内毒索相互作用产生的相应独度反应来定量或定性测定内毒素的试验方法，3.28
确认validatlon
对试验步骤、记录和结果解释形成文件的程序，需证实,产品持续符合规定的要求。4通则
4.1文件
4.1.1经批准的试验技术程序和作业指导书，应放于相关设备处以便使用，并应按质量体系规定的要求使其受控，
4.1.2计算和数据传递应得到相应的核查注：如果计算是使电子数据处理技术、宜针对预期使用对使用的软件进行确认，并保留确认记录，4.1.3原始观察记录、计算、导出数据以及最终报告应按质量休系的规定予以保存。记录中应包括参与样品制备和检验的人员的识别。4.2人员
4.2.1应按质量体系规定要求安排专人负责进行细菌内毒素试验。3
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4.2.2应按成文件的程序进行培训，并应保存检验人员的相关资质确认，培训和经验的记录。4.2.3检验人员在进行细菌内毒素试验之前应先对其进行资质确认（见8.3.3)。4.3设备
4.3.1应具备进行规定试验和测定所需的全部设备，并应按形成文件的程序进行定期维护和校准。应保存维护和校推记录。
4.3.2所有设备应按照规定要求操作并形成文件。4.4试剂和材料
4.4.1对细菌内毒素试验（包括质景试验）中所用的试剂、对照品和参照材料的制备应建立.方法并形成文件。
注：质控制试验宜包括營试剂灵敏度友核试验，4.4.2应建立细菌内萨素试验所用玻璃器血和其他耐热器具的除热原方法，予以确认并形成文件。注：器具除热原方法参见GB/T14233.2—20054.4.3细菌内毒索试验所用材料如不经除热原处理应证实无可检出的内毒素，可通过对采购材料的抽样检验来证实其无热原或认可供方出具的证明材料。注，用于取样,贮存或稀释的穿器应对试验无干扰作用,例如聚丙烯显示抑制内毒囊测定。5无热原标识
5.1直接或间接接触心血管系统，淋巴系统或脑脊液的产品，或是可能与该类系统接触的产品（如给液器、输送器、导管、植人物和输液配件）、或是眼内使用的眼科产品（如硅油、粘弹性产品、眼内透镜）均应评价内毒素。
5.2任何采用标识标称无热原的产品应具有确切的证明，这些证明可包括：一由有资质的人员采用确认过的细菌内毒紊试验对产品的直接检验；一对无热原生产运行确认已形成文件，或一符合某一适用标准和(或)要求的其他证据。5.3试验过程应包括标称无热原产品的所有部分。标称无热原液路”应通过对所用液路组件和液路表面的适当评价来提供支持。
5.4对于多组作的成套产品，标识和（或）标称应与各组件内毒素合格评价文件相·致，这种标识宜与成套产品和组件的预期临珠应用相一致。对丁必须使用“无热原”术语的特殊组件应对全部组成部分给出适宜的评价。
5.5应在产品临床应用的基础上依据适用的强制性标准确定标识出的合格限值。注1GB/T14233.2—2005中推荐给出了医用液（血）,注射器具的内毒素限值。6单位产品选择
6.1细菌内毒素试验单位产品的选择抽样规测是基于生产过程受控的前提下，并且符合质量体系要求。
6.2应根据抽样方案规定的规则选择试验单位产品、抽样方案宜规定样本量（6.3）、抽样组（6.4）、以及其他有关抽样规则（6.5~~6.7)。6.3样本量应根据抽样方案中规定的准则来确定，抽样方案准则可依据适用法规要求、引用出版的统计学方案或指南，或是根据生产运行确认。6.4抽样组一般限定为生产批。如有数据支持其他选择依据，样本选择可基于非生产批抽样组。如采用跳批检验（见B.3.2)，产品可按分类进行试验，跳批检验要求见第10章。让：非生产批抽样组的规范宜包括风险评定，以评价抽样组组成规则的适宜性。6.5宜从城品中抽取试验样品，以包括所有可能影喇或产生内毒素水平的因索（例如包装）。注：用于内毒素试验的样品可从因其他产品质量问题而导致拒收的产品中拍取，前提是该拒收样品能代表非拒收产品。YY/T 0618—2007
6.6样品可包括火菌前和灭菌后产品。灭菌后的样品能包含所有可能影响产品或内毒素试验的因素，如选择灭菌前的样品进行试验，对样本的可接受性应形成文件。所开展的试验程序宜能反映灭菌前、后的样品。
注，对丁促微生物生长的产品，选择在灭菌前抽样可能不合适。6.7在多组件成套产品检验中，可将每一组件或整套产品视为一个器械。在对每一组件捡验的情况下，宜使用标准试验步骤。成套产品作为一个独立单位检验时，必须考虑方法所要求的样品制备以及适用的产品内毒素限值。B, 3,3 和B.3.4 中给出了附加指南。7方法选择
7.1有三种细菌内毒素方法可供检测实验室选择，每种方法均有多种文献，指南和品说明，宜在对实验空技术人员、验证、样品要求、数据处埋要求和试验样品性质充分考虑和评价后做出方法选样。当前技术和方法包括：
a）凝胶法：限量试验和测定方法；b）显色基质法：动力学和终点方法心）浊度法：动力学和终点方法。三种方法的信息参见附录 B。
7.2所选方法应按第8章进行确认。注：如试验方法或技术变更，必须重新进行确认（见8.6)。8方法学确认
8.1试验内毒素限值的确定
在进行细菌内毒素试验之前，必须确定产品在试验条件下的试验内毒索限值，试验内毒索限值定义为内莓素最大允许浓度，即产品浸提液中所含有的内毒紊与产品内毒素限值相关，产品内毒素限值可由相应标准中获得。试验内毒案限值按式（1)计算：CKN
...( 1)
C-一医疗器械试验内释素限值，单位为内毒紫单位每毫升（EU/ⅡmL);K—每件器械内毒素允许限值；
N供试器械数量；
V样品冲洗液总量，单位为毫升（mL）。8.2最大有效稀释倍数(MVD）
如认为产品对细菌内毒紊试验可能有抑制作用，可采取用细菌内毒素检查用水或其他适宜稀释剂稀释的方法解除于扰作用。但是，稀释也会造成对可能存在的内毒索的稀释，因此要有一个允许稀释限度。最大有效稀释倍数按式(2)计算：MVD =C
式中：
最大有效稀释倍数；
试验内素限值,按式(1)计算的内毒索限值：C
经确认的鲨试剂标示灵敏度（凝胶法）或用于绘制标准曲线的最低内毒素稀释液（显色基质和浊度法）。
根据鲨试剂灵敏度得出的MVD值是指在去除抑制作用时所能采用的稀释倍数，如MVI为4，即可进行1：4稀释。
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8.3试剂复核和检验人员资质
8.3.1预试验（盟试剂标示灵数度/线性范困复核试验）8.3.1.1凝胶法：每批鲨试剂标示灵敏度（1)必须来用在入范围内的内毒素4个系列稀释液（例如：241、0.5^、0.25)试验进行验证，内萨素系列稀释液反应终点浓度的儿何平均值必须在入土2之间。标示灵敏度确定后用于所有计算，标示灵敏度几何平均值按式(3)计算：A - lg-'(Ze/F)
武中：
一标示灵敏度几何平均值；
Z—内毒素系列稀释液反应终点浓度的对数值之和;一平行试管数
.---..(3 )
8.3.1.2显色基质法/独度法：验证需证实线性标准曲线在实验室常规试验用内毒素稀释液的范围之内，形成该标准曲线至少需3个内毒素浓度，如果该标谁曲线范围大于21g区间，则在该范围内每增加11g区间，即添加一个标准浓度。每一内毒素浓度应平行操作三管。在初次质量控制试验中，不宜平均各点来证实线性。根据线性回归分析，鲨试剂制造商标示内毒素范围标准曲线的相关系数（)的绝对值应20.980。
8.3.2内毒素工作标准品标定
对实验室所用内毒索工作标准品与鲨试剂批号间的特定结合活性必须进行测定并形成文件。可确认试剂制造商提供的分析证书，或由实验室进行标定。8.3.3检验人员资质
必须证实细菌内毒素试验检验人员的能力，检验人员进行资质监定时按8.3.1步骤操作。8.4产品确认
8.4. 1 总则
每一产品或产品组（见B.3.2)必须进行鉴定/确认，以充分证明试验样品对细菌内毒试验系统不会产生抑制、增强或其他干扰作用。样品干扰方面信息见8.5。8.4.2和8.4.3给出了产品鉴定方法，8.4.2凝胶法
8.4.2.1每种产品或产品类别应取3批用于韧次鉴定/确认试验。8.4.2.2按表1制备溶液。样品溶液稀释倍数必须小于或等于MVD，不能检出任何内毒素。检验各内毒素稀释系列和阴性对照，各内毒索稀释系列的几何半均终点浓度应按8.3.1预试验所列公式确定，
表1凝胶法干扰试验溶液制备
产品阳性对照系列
产品阴性对照
标推对照系列
阴性对照
稀释液
样品溶液
样品溶液
细菌内毒素检查用水
细菌内毒素检查用水
内毒素系列稀干液
制备 2h 溶液、24 的
2 倍系列稀释液
制备 24 溶液、21 的
2 倍系列稀释液
内毒素浓度
不适用
不适用
试管数
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8.4.2.3如鲨试剂灵敏度在产品阳性对照系列的0.51~21之间，阴性对照显示无反应，标准对照系列结果证实藏试剂的标示灵敏度，则样品不含有干扰因子。8.4.3显色基质法和浊度法
8.4.3.1选择标准曲线中点或一个靠近中点的内寿素浓度，按表2所列制备溶液，采用适宜的试验方法检验各溶液，与所用鲨试剂适配。表2显色基质法和浊度法于扰试验溶液制备溶液
产品阳性对照
样品浴液
标推对照系列
阴性对照
稀释剂
样品溶液
样品溶液
细菌内毒素检查用水
细菌内毒素检查用水
内再素系列稀释液
标准曲线中间淤度
至少包含元的3个不同浓度
最少试管数
每浓度2
8.4.3.2从产品阳性对照中减去样品溶液的平均内毒素浓度，计算添加内毒素的平均回收率。8.4.3.3如产品阳性对照测得浓度在已知添加内毒素液度的50%～200%内（减去样品溶液检出内毒素后），则认为样品或样品稀释液无于扰因子。8.5样品干扰
8.5.1细菌内毒素试验中如出现干扰现象，可通过适当的处置来去除干扰。样品浸提液可采用稀释和（或）处置来去除抑制或增强作用，以测定内毒素浓度。样品的处置方法包括稀释，采用其他试剂、加热变性等。如必须超出MVD，可采用超滤和回收方法来浓缩样品浸提液，并对提出的方法进行确认。所有样品操作应规定确认数据，并且在常规试验中采用。8.5.2可选用不向制造商的鲨试剂、不同的鲨试剂灵敏度和不同的细菌内毒素试验方法，以便排除下扰作用。
8.5.3可用无热原三羟甲基氨基甲烷（TRIS)缓冲液稀释样品，或用无热原氢氧化钠或盐酸游液中和样品浸提液 pH。
8.5.4可用阳离子缓冲液（MgSO.或MgCl.）稀释样品来调节离子浓度。注：例如肝紊是一种可产生离子干扰作用的物质。8.5.5显示增强作用的样品应检查是否为鲨试剂反应性材料。例如，在检验可能有鲨试剂反应性材料干扰作用的样品时，宜通过加和不加特异性内毒素缓冲液来消除增强作用的可能性。注：酵母菌和霉菌细胞壁以及纤维材料为鲨试剂反应性材料。8.5.6当试验条件发生任何改变可能影响试验结果时应重复干扰因了试验。8.6有效性的维持
8.6.1在下列情况下应取三批重新进行确认：a）产品改变可能影响试验；
b）技术变更（如凝胶法改换为显色基质法）；试验参数改变（如样品浸提参数）。8.6.2在下列情况下取一批进行确认：a）实验室改变（非8.6.1的改变)；h)
鲨试剂制造商变更；
试验材料、设备的改变可能影响试验；置试剂灵敏度改变。
注阳性产品对照可用于确认目的。在-定条件下，阳性产品对照适用于检验某种变化。7
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9试验方法
9.1标准试验参数
9.1.1温度
细菌内声素试验方法孵育温度通常为（37+1)℃。9.1.2时间
益试剂制造商的使用说明书给出了试剂加人和孵育时间，细菌内毒素试验凝胶法孵育时间通常为（60±2)min。
9. 1. 3pH 值
细菌内毒素试验发生反应的最适宜pH值范围为6一8，如超出该范用可能会导致干扰作用。确认时宜采用适宜的试验系统对种产品的3批浸提液的pH值进行测定，如确认试验中不需要调整pH值，则以后试验时也无需调整但是，如确认试验中调整了pH值，则每次试验必须测定pH值。9.2设备和试剂
9.2.1由于细苗内毒养试骑要求限定温度范围用于凝胶试验瞬育的加热箱或水浴宜绘制热分布图。机械移液管（包括固定式的可调的和反复用的）必须是期进行校准如实验享采用显色基质法或浊度微用说明和确认要求对硬伴
和软件进行确认
法，必须按照制造商的
板）应在使用前进行评价
见4.4.3）以确保不
9.2.2试验所用的全部鲨试剂应是有证产不是无热原供应的材料（如酶标扰检测实验室的测定。
9.2.3内毒素工作
准品的活性应用内声素国家标准品进行标定，用检测实验室进行或由鲨试剂制造商提供给检测实验室
定文件。
9.2.4鲨试剂制造商车产品标签上会命出冻干试剂和复溶试剂的是存要求。实验室的贮存条件如与制造商推荐的条件石！
则应对贮存条件免费标准bzxz.net
进行确认。
9.2.5细菌内毒系试验要求使用细菌内带素检查用水，这种水对实验室所采用的试验或测定法无反应性。内毒素检查用水用
9.3样品制备
9.3.1总则
复溶试剂稀释内盖素标准品、冲洗或浸泡器械和稀释程品，用于试验的样品宜越照制造商的说明采集和常规细菌内毒素试验须采用确认时所用的方液，所用浸提方法根据产品无热原的情况而定，产品可经冲洗或浸池来制备试验洗提液或浸提注：FDA导则（1987）认为缩事内事素试验的漫提不彻底，囚此为保证患者的安全，内避素限值是在考虑到安全因素的情况下建立的（见第A章GB/T14233.2—2005中规定了输液、输血注射器具细菌内毒素试验浸提方法。
9.3.2医疗器械
器械用内毒素检查用水冲洗或浸泡来制备样品浸提液，可使用除热原器具切割或分解器械以用于浸提。最短浸提时间为37℃15min、控制室温（一般为18℃~-25℃）下1h或其他经确认的同等条件。对标示“无热原液路”的器械，将已加热至37℃的内毒素检查用水注人液路，使浸提介质与液路接触，在控制室温（一般为18℃～25℃）下浸提不少于1h。用于浸提器械的内素检查用水的体积可根据器械的尺寸而定，用于浸提的最大有效稀释倍数或最大浸提液量的计算见8.2。为了去除干扰作用，样品浸提液可稀释至不超过计算出的最大有效稀释倍数。
9.4常规试验和监控
9.4.1凝胶限量试验
制备并检验表3中列出的溶液。样品溶液和产品阳性对照宜制备成不超过最大有效稀释倍数的稀释液。8
样品溶液
产品阳性对照
阳性对照
阴性对照
9.4.2凝胶法
表3凝胶限量试验溶液制备
稀释剂
样品溶液
样品溶液
内毒素检查用水
内毒素检查用水
内毒素稀释液
YY/T0618—2007
试管数
按表4所列制备溶液。样品溶液稀释不得大于最大有效稀释倍数，对样品溶液进行系列稀释是将一种含内毒素的样品稀释至冬点，以利于确认。除非样品原液出现阳性结果，一般没必要检验全部系列稀释液。
试验液
样品溶液
产品阳性对照
标准对照系列
阴性对照
C静释剂
样品溶液
内降素检查用
内毒素检查用水
内毒素检查用水
样品溶液
仅在样品原液
内毒素检查用
内毒素检容用水
寸毒素检查用
毒素检用才
内年素检查用
凝胶法溶液制备
内毒紫科
制备认溶液
2倍稀释液
释释倍教
中内享素时进行检验在这种情魂下葡先制备2倍稀释液。9.4.3显色基质法
常规试验方法见
9.4.4试验频次
内毒素浓度
本适用
最少试管数
应按照已形成文件的捕样案所规定的抽样次数和样品数进行细苗内毒素试验（见第6章）。选择的抽样频次应适当，以保证所有批次的内毒素水平能符合规定的限值。成品试验次数的确定也可能受
到一些因素的影响，如对牛产过程和材料的控制程度、关键性原材料的检验步骤、和（或）过程中的监控。非逐批检验的试验次数见第10章。9.5结果解释
9.5.1有效的常规试验要求出现下列结果：凝胶试验中，标准对照系列的入在0.5入～2入范用内。显色基质试验和浊度试验标准曲线的最a)
小（%）值为0.980；
阴性对照无反应（全部方法）：凝胶试验中，产品阳性对照为阳性结果。显色基质法和浊度法中产品阳性对照回收率在已知添加内毒素浓度的50%～200%范围内。9.5.2凝胶限量试验中，试验的各有效参数符合9.5.1，并且样品溶液两支试管均为阴性结果，则检品是可接受的。如有效参数不符合要求，可结合实验室试验采取以下措施：9
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