【农业行业标准(NY)】 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程

中华人民共和国业行业标准
NY/T 402—2000
脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程Rules for ylrus detection of virus-freeseed (seedling) sweetpotatoes2000 -09-22 发布
中华人民共和国农业部发布
2000-12-01实施
NY/T 4022000
为了有效地实施别脱毒甘营种著（苗）质量俭验和管理，规范脱每方害种著（苗）市场促注日落脱率技术推广，实现说毒甘些种要（苗)病毒检薄的范化，标生化,特制庭本规程。本熟程车参照国内外甘等病毒拉测技光量新讲究进展的基础工：结合当前国内生产实示，力求达到快迄，准确、可操作性避的检测要求。检划对象主要选择生产上发生分行范用广，危害性大的病，愉须力法土要采用猎示植物检测和证点悔联免疫吸附检测方齿。
车规程容包括脱毒甘普种费（南）病毒检澳关退用范固检测对象，抽样方法、检测方达和质量发求。
本标猫的附录A附录R都是标准的附录。本标准山中华人民共和国农业部提用：本怀准主要起革单位，农业部物脱毒种声质量监督检验测试心（济南）、山东咨拍物保护总站，本标准主要起草人；孙作文、商明清、率明立、刘收求、扬勤民、任宝等。1范围
中华人民共和国农业行业标准
脱囊甘薛种薯（苗）霉检测技术规程Huk's far virus detertion of virua-freeseed(seedlicg)wwref polatoes本标难规定？脱甘善种（苗）的病垂趋测方法和操作规程本标准适用于脱毒廿密种兽（苗）的病检测，2定义
本标症采月下定义。
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应用举尖纠划培养持术获得的再生试管苗，经检测确认不带甘薯到状斑驳病事（SPFMV)和甘幕泄隐病毒(SPLV?才确认是脱事苗，2.2脱毒种（由）
从第殖脱毒苗开始，经递代第殖增加种萼（苗》数基的种薯（苗1生产体系生产出来的。分源原种、原种、生产用种三个级别，
2.2.1原原种pre-elite
用脱却苗在防虫网室、温完条件下生产的符台质量标推的种尊（苗)。2.2.2 原种 elite
用原原种作种整，在良好隔离策件下生产出的荐合质量标准的种要（苗）。2.2.3生产用#certified sced o:seedling用原种作种普：在隔离录件下生产出的符合质量标确的种薯（苗）。2.3摘毒病株允许率
指答级甘营种蘑（苗）繁殖田中病毒痣株的充许比率。3、检别对高
甘薯州状斑病(Sweelpolatofea:herymotrievirug,sPPMV)式物滋隐摘毒(SwectporatolatentvirusSPI.)4抽样
4.1组培苗抽样
4.1.1脱毒核材料：每端必须检测。4.1.2扩需南随机.抽度1%~25的扩掌萌检测4.2日间抽样
4.2.1原原种和原种抽样：定植后31天、60天无，收获前2间，在目测全田的基础上采用五点取样法，中华人民共和日农业邮2000-09-22批准2000 -12 -01 实施
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抽样数量考0.1hm以下200样，0.1.~）hm*600米，超山1hm面积，划出另-检验区，接车规规定的mi积取详。每株最.上，中，下部叶片1~-5g·低温媒湿存放，24h内检测4.2.7生产用单油择，余准后30天，收然前两两，在甘测的基础上,来,过随就取样法,U.1hrn以下检验2点，每点10珠：0.11~.1m检验五点，每点100株1.1~~5hm检验10点，带点1，超出5hrm面，出另一难验区：按本热程规定的面视取栏。取样诺及详品保存可4.2.1.4.3商种要编单
没有经过问检验的冲普（曲)必须进行决根或神苗检验4.3.1根据书些件事（苗>不同收方式，采用分层设点取样或随机取样，栏效要见表1。装1拍样数量标准表
和事“苗总量
,10 ciK抹
-10 x袜
sa nookg
>1 DOD kg
注：不足抽样最数显的垒作为源合详品。抽样百分率，
ti-~lc
Ioc kg
4.3-2将第--沈抽取的样品混合后，进行次油样，机抽取1不拍据合样品测，5抢测方法
5.1低点酶送免验吸附(Ler-ELISA)验测法胃于检测其等没状斑骏病滴毒和其要潜隐病毒：检划法无附录45.2指示植物控测偿
用十辅助检训甘普测状斑坚病毒和甘普潜病毒，检测方法见附录.检测廿尊病率的指示档物及症状见丧2。表2控测当整病带的指示有物及症状树毒种然
需量要求
巴四辛牛
比斑点醇底免接吸床检测或指示植物验测呈阳性者为带事革（苗)。原原和：病毒病株充评率是心。原种：病毒病米分评率3.0浆：
生产片种：病病株充许率：0
A1溶液配制
NY/TA02-·2000
附来A
（标准的附录）
班点脚联免疫检测法
所用化学试剂为分析纯级斯格，月水为蒸馏水，A1.1—经甲基氨基甲烷(THS)(pH7.5)Tris Ba5e
赢化镇(NaCI)
（Na）
溶于1SSCml蒸馅求中，月热酸37%>试pH至7.3,定容至20mmml.,A1.2洗涤缓冲糖(TTBS)
1.0I.组-2)-2)搭000mTB中。
41.3抽提链冲液
亚殖酸钠(NazSO,>C.20g游于TBS中，定穿至100mLA1.4封闭經冲械(现用现配)
脱脂奶粉
轻通 X-10n:Tritnn X-J00)
先将现皆奶粉搭解于少年TBS中，再用TES定睿至2mT，.TriconX-100混合均句。A1.5抗体稀释缓冲液
脱脂奶粉
光将频弱奶粉解于少量TBS中，再用TBS定李至5Imt.，A1.6底物级冲液（pH9.5)
Trin Base
甄化纳Nac
氧化镇（MgC1.·6H,0)
叠氨钢(NV)
落453ml.蒸瘤水中，用充益微调pH值些9.5定穿至50)ml，。A1.7硝热四唑(NBT)和 E激-4鼠·3-吲案磷酸酯(BCIP)能备液T能各池！
70KN.N-二甲基甲院
混合均句，4心避出保存。
TSCTP储备液：
70%N,N-二压基压酰脑
混合均句，4Y避光保存
A1.日废物落液(现用现配)
底物缓冲被
NBT储备液
ECT储备液
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先将NBT储备接溶25mL底物爆冲液中，再还滴加入BCIP储备液.边切达振据混勾，A2样品副音
将待测叶片用满水消洗十孕，从每一样品叶片上各段一直径约1cm國片放入样品袋中，地人3mL抽提缓冲滤充分研磨，4℃静宽30~-40min，取滤清汁滤点悼，样品火块根时催半外理后取纳步、叶制样。
A3基作步累下载标准就来标准下载网
A31点样，将打好方格的硝化纤维末膜过T缝冲减处理后放在洁净的滤纸上，每个样品各吸取1？μL上满波滴在膜上方格的正中：干燥15～3(min。同耐设性，阴性和空白对照，可根据需要设置重。
43.2封闭：将十燥.后的膜没泡在闭短冲夜中，室温上摇床报荡（501/min)1h，A3.3有第一抗体，将膜原于过抗缓冲摘那释至工作浓度的抗血清中，室握下探床摘满（50/min）过夜。
A3.4洗涤：用洗探缓冲液洗膜3饮，每次报床振璃（10Cr/min)amin。A3.5解育第二筑体：将这直于用托冲释样牟工烂浓度的酶标体中，室温下摇床抵菌(50r/min)1h.
A3. 6洗涤;洗涤 4 次,方法同A3. 4。A3.7显色，将膜置丁NT/CJP底物溶滚中室温下播床振菌（50/min>解育34minA3.日等止反应：弃去底物率液并用蒸愉水洗膜3次，每次摄床振满（100r/min)3mi。A3.9阳性判断，收干后观案色反成，出现蓝紫色潮色反应的样品为阳性。的育指示物
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附录B
（标准的附）
指示拉物检测法
在既史兼件下盘裁巴西率牛，至1～2片算叶时嫁。B2皖接
以待测样品的营蔓为接稳，西牵牛为碚木，在巴西事牛的茎部（子叶以下)教划。将特检样品蔓切成3~5段，每段带有至少一个腋年，去叶后将底端削成模型，插人码木的切口内，用村口映扎紧，置26--32防主网室内遮药保显2--火，每个推的重复3--5次：同时设旧性对照、附性对照。熔接10--15天后观察记戴症状，
B3阳性薄断
根期清示植物症状，确定病幸有光及种类：在所有嫁接的指示植物中只要有一株表现典型症状，该婵品时为阳拦。
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