【农业行业标准(NY)】 脱毒苹果母本树及苗木病毒检测技术规程

中华人民共和国农业行业标准
NY/T 403-2000
脱毒苹果母本树及
苗木病毒检测技术规程
Rules for virus detection of virus-frccmothcr trcc and seedling apples2000-09-22发布
中华人民共和国农业部发布
2000-12-01实施
N/T403-2000
为，有效地实施对脱毒苹果苗木武量检题和雪理规范脱毒苗木市场，任进脱毒技术的推广：实现脱每带果当不病毒检谢的规范化，标准化，特制境本现程。本规程在照国内外苹果病声检测技本发新研实进展的其础上，结合当前国内光产实环，力求达到快理，准确，可操心性强的检测要求：检测以象主要选择生产上发生分布范、危害性大的病毒。整测方法土要来用指示植物检测和A蛋口爽心联免疫骏检测。
不规程内容包括脱毒带果母本树及苗本病毒检测的道用范围、检测对象，捐样方法，检测方法和质要来
本标准的附录A是标准的附录。
本标准由中华人民块和当农业部提山。本标演主要起草单位：业部植物脱牵种古质量监新检跑测试中心济南），山省植物保护总站。本标准半要起常人，事明文，刘带，商明消，作崇判·你作文，任宝珍。1范围
中华人民共和国农业行业标准
脱毒苹果母本树及
苗木病毒检测技术规程
Rules for virus detection of jrus-freemother tree anl seedling apples本标准规定了脱毒革果母本树及木的病市检测方法和操作现程。NY/T 4032000
本标适用于脱李范来母本树（矿不凉种，接德！组培菌及说毒苗小的病牵检测2引用标准
心究标准所他含的系文通过在平标准中引用而理为平标准的条支，牛标准出版时所示版本均为有效：新有标准帮会被峰订使月术标准的各方应操计使用下列标准最亲版六的可能生。GB129431SS1平果无病母车树和苗本抢送期涯NY82J-1957苹果元病每凸大
3定义
术标准采开下列定义.
3.1苹果无洞本
用苹果无病车原冲材料繁育月于提失起种接德或营齐系站小的每咪（足NY329--1997中3.：？。3.2苹果无病牵苗和
用尤病毒接感杆元病事贴水著分的苹果综接凿或无痕丧材料通过组织培美方法案育的毒果自限由(见32—9中3.8)。
4检测对象
平果想绿叶班病毒ApplechlororieleafspvrvinusAcV)：苹果草痘润毒（ApplestuupillingviruiAsPV)苹果蒸沟猫（AppleatengrnkingvirusAsGV），5抽样
5.1腔毒母本树拼样
每株均需控测.季从待检母本因上选取嫩芽或幼激可片或花期的新鲜龙（述抵期收-年生技条的区层)作为查测样品。
5.2组培苗的植橙
5.2.1脱毒核心材料：每株均需检通。5.2.2累丝培苗，每以扩驾随机抽取1%~2%的样品检测。中华人民共和国农业部2000-的-22批道2000-12-01实施
5.3当国的博样
NY/T 403-- 2000
来用分忌成详或险机取挡等方达抽取单品，抽誉款量见表1。将第-次拍取的样品混台后进行二次报样，随机抽取10%的混会样品检测。表1苗木抽样数虽标准表
荫木总数量，株
注：足示产展低效量的人部作为合栏品6检测方法
6.1指示植物检测法
按G月123943-1991中=.4据毒枪验办法执行。6.2A蛋白夹心酶联免点吸附检测法。控测方法见录A，
7质量要求
醇联争检测或脂示物垃测呈阳性反应的为带奔株。母水研病在病株充许率为0。
脱再齿木：病毒病袜许率%。
抽样安低效量，梯
A1溶液配制
NY/T 4032000
附录A
（标准的附录》
点蛋白来心酶联免吸附检测法
所用化学试剂为分析纠级规格，用水为蒸焰水。A1.1像冲液PRST.FH7.
氯化钠Na心
磷酸二垫（KH,PO,）
磷酸氢二钠（NLHPO+-1HO）
戴化钾(KCI)
t温-20(Tween-25)
游卡热增水中，定穿至10CCrmL,4孕保存.A1.2抽挺滚冲被
深乙烯咯婉丽Mwu-
牛白黄白
1000mPBST中4保，
A1.3包核冲液（pH9.6）
酸酸NCWww.bzxZ.net
碳牌至的NaX
的NaN
率于蒸本中，定客车1让4保存，A1.4物缓冲液
二乙酵胺
客(NaN）
2.93g[或N,HPD,,1. 1E?
溶于800mL蒸痛水中，用2mol/L盐牌调PH率9.8.定至1000㎡L+4保在。A1.5总物落拨（现用现配）
0.05肾4·硝基苯酶醚酸益溶于50 mT.物冲液中，A2样品制备
取待检栏品 0. 5~.1. 0 多,加入 5 ml 抽提短液研磨,4 00 1/min 离心 5 1uit,取三消被备用43操作步骤
43.！包被A蛋白：每孔如100用包接冲滤接工作浓度蒂格的A蛋白，37保湿2h，A3.2洗板：用洗涤级冲商洗板4次.每次3~5mim。A3.3包被第抗体，每孔T100aLPB5T费T作达度希释的抗位，A7保显孵育2h。A3.4洗板：同43.2.
43.5包装品：每孔切10L+4C保湿过夜。同时没附性、性私空自对照可退据需要设置更复A3.6洗板：雨洗涤短冲液洗板4~3次，每次3=mn。A3.7包被第二抗体：每么10GμL用PBST按T作液度稀释的元体，37C媒湿解育2h，A3.8统：同A3.2.
NYT 403—2000
43.9包被醇标A蛋当：每孔加1CμT.用PTST接工作浓度释的碱性磷酸酸酶标记的A户,37C保随育2h。
A3.10洗板同A2.2.
A3.11加滤物：梦孔加100i.底物溶液.3个应1A3. 12
酶联些测：用酶联检测慢烫定10.nm的光激义值(<>D>），记录反应结果。捡洲为。
H生判断标准：崩桂对照ODm
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