【农业行业标准(NY)】 脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程

中华人民共和国农业行业标准
NY/T401—2000
脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程Rules for virus detection of virus-freeseed(seedling)polatoes
2000-09-22发布
中华人民共和国农业部发市
2000-12-01实施
NY/T401-2000
对丁有效韭实施对脱毒马铃整种尊质世检验利管理，规范脱毒马铃善种些市场，促逆马恰案脱毒技六推广，实现脱再种葬病声检测关规范化、标准化，等制宽本规程，本现程在参熙匡闪外马铃薯病毒检测技人最新研究进展的基础上续合当前围内尘产实际，力求达划快速准确，可操作性强的检测要求。检测对象十要选择牛产发牛分布范币广，危半生大的病毒.检测力法下要采用青示植物检测和双执怀关心酶联免疫及对检测方法，而类将毒检测采用指示模物检测、往邀电泳或反转录聚合醛链反应检测方法
本期租内咨包括说毒与铃离种事（苗》病牵险测的适用范围、检测对象、拍样方法、检测方法析质量要求
本标准的附录人、附录B、附录乙舒是标准的附录。本标准出中华人民共和区农业部提出。本标准土要超点单位：农业植物脱市种苗质量监督检验源试中心（济南）、山东省植物保护总站。本标准主要起草人：科作文、下同伟、商明尚、协药民、徐鲁、刘敬乐。1范围
中华人民共和国农业行业标准
脱囊马铃善种薯（黄)病毒检测技术规程Rules for virus detectioo of rirws frerseed (sredling)poinloes
本标准规定了脱毒马轮要冲再、组增芦的病毒增测了法和择作现毛：本你追道月丁脱牵马获种皆、组培尊的病变检划。2引用标准
NY/I 401--2000
！标准所包合的杀文，通过在三标准中引用而成大本标冶拍条文。本除满出版时，所示版本均为有效，所有标准都会做整订，使用<标准的各力度探划使正下测标带最新版本的可能，GB73311987转些钟些产地检度划程GB1813H—2000马铃警脱海种票
3定文
公标准采用下列定义。
3.1说毒南
应同紫少组织培养技木关得的再士试普出经测确认不带孕轮普病PV）铃算Y痛毒(PVY),可轻响5病毒(PVS)马铃要卷叶病表(P1.RV)等病市和马龄衰练湿块紫类病牵(PSTVd),不确是脱肃式。
3.2税毒种善
以案纳聪再苗并始，经逐代然的墙加种营数望的落生产体系定产出来的，脱毒和营分为基础利整和台格种酱两类，基础种酱是背用小生产个情种等的原床种式原和；合格种是指月于生产所品的种班。
3.2.1茎种（分为级）
3.2. 1. 1 原原种Pre-eline
用脱毒当在容器内生产的微型警（mirrlr)知在险害网室、标案杀生下生产出符合预标举的署或小哥(miuitule）
级原动elite
3. 2. 1.2
用京原种法种些，车良好隔略条件下牛产出的守个质步标准的制营。3.2.1.3二级原冲elite1
用一级原种作种变，在良好网离杀牛下生产止的符个些标准的升套。32.2合格种等（分级）
3. 2. 2. 1-敏冲菩certified grate]开一级派种作种要，在展离案件下生产出的符个质标难的那营。3.2.2.2二级种学eetifirdgrT
中华人民共和单农业部2000-09-72批准2000-12-01实瓶
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出-级种堂作种普，在确高条件下生产回的符个质早长准的种掌3.3书辆样元许率
脱种学紧殖用中病专病述的允许比率，4检测对象
马铃善X编每(PutatuvirusX,PVX)：乌龄薯Y市毒(Pmaln virus Y,PVY)铃等S病率（PotatovirusS.PvS);马铃前卷F海来（Po1A:nleafrollvirusLRV)铃纺块紫奖病（Potutosuindie:tubcrviroidPsTvd）。5抽样
5.1组培苗仙样
5.1.：脱率核心材料，每株必须检5.1.2扩案苗随让油取1%~2的需苗检测：5.2用拼择
口三推样数没拥样时期应符合GB1332000中6.2的划定，5.3商品艺拍择
没有经逆田间检验的种整必逊行块禁验验5.3.1根据种落不同存放方或，采月分恶没点政样或机取样法油样数量见表1。表1抽价激量标伴表
种营总基，
12 ong
>13ono
计，不足最低数量的即所为合排品，抽择百分率，%
G·-16
抽样量低数地，
5.3.2将第次灿取的性品消合片，述行二次排性随机最10为的滤合举品检测，6检测方法
6.1指示拉物测法
按G73311087中F4规定的方法款行，6.2双护夹心悔联免变检测法
检测方法兄能亲人，
6.3代退电热检测法或反我叉-率合醇钮反应（RT-PCR检测法用登测与龄药块炎病市，检测法见求和附。？质量要求
凡指示殖物检测酶联免疫检测、往退电染检测或RTPCR拉测呈阳生支成靠种学（萨）芒级种费病株病毒允评率应符个Gm13133—200中第5亨的规定。A1溶液配制
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附录A
（际弹的闲录）
双抗体夹心酶联免疫检测法
所月化学过剂为分析安级规格，用水为蒸焰求。A1.1统涤缓冲液(PBSTFH7.4)
数化销(NaC)
渐醛二氢卵(KFI,PCI,)）
磷殿氢_.钠rNa.HP,-12H,O)
鼠化钾(k心
-2(Twc 20)
C, 2 g
2.93 g(& Na,HPO, 1. 15 g)
溶于获润水中,定容卒 1 00℃ ml.,4 C保存,A1.2批摄缓冲载(PH7.4)
2U.UUg奈乙烯咯烷（MW-4m溶可1mPBT中。A7.3包被妥冲液pH9.
根酸码Na
微酸全钠(NaIIC)3
盈密销（NaN
落」然求定容至」u3m4C架存。
Ai.4 封极波
牛将白蛋心（或脱胎奶粉）
深乙滞吡略院MWw）
于10mLFHST中，4心侯存
A1.5酶标忧依蒂率缓冲派
牛造自片（脱腾好）
聚乙烯吡咯烷酮（MW.-）
家纳NN
洛于100mLPEST中1保存。
A1. 6 底物缓和液
三乙醇胺
登筑钢NN
9i rrL
落于00l.蒸增水中，用mo/益骏调至98定套单1000m.1C保存。AT.了族物浴（现问现店）
2.05g-硝片米嫩酸盐1.底物缓液中。42祥品制爸
取样品0.3--1,0g-时入5mL油提缓冲夜，善4000rmim离心5min,成1消液各月A3操作步题
3位识抗体，孔100用包被缓冲滤按二作浓照筛释的扩?忘能解？-℃保3
湿过夜。
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A3.2洗板，用洗深领冲液洗板4次，每次3~minA3.3封版：每孔加2叫封板微：34课湿游育1-21A3.4洗板可A3.2
3.5包起样品：每孔加样品100=.24C送湿帮宵2~1减4保靠过夜。司时收阴性、月标满专的阳性和空白别照，可根据需要设實重克：A3.6洗板：月洗涤袋冲液洗假4--8次，每次3--5min。A3.7包被标抗体：每孔加100uL用抗体稀释冲液秘科到工作液度的减性磷酸酮降标记抗体37有2~-4h。
43.8洗检，可A3.2，
3.9打底物辫液，年孔加1m0证37心保流案你下反1h.A3.10醇稳测避联验测仪测余405m的光吸收值（0T20），记录反成结果，为阳
阳性列断标准：爵钙对脆OD.
附录B
（准时录）
往返电泳检测法
R1溶滋配制
所用化学试前为分纯级规格，用水为葬馏水。B1.1油提圾冲液(HT.5)
三降中基需*甲烷(Tria）
Z一胺乙酸(ETTA)
氯亿NaC）
济于800mL蒸馆寸，用盘牌调pH7.5.定穿案1000ml.14C保存.B1.21BE电沫餐冲微(FH8.3)
, 93 g
溶于蒸烯水中，足容至1m..4保存.B1.3%聚丙烯酸胺凝胶配点
30元丙烯既胶-甲叉双丙烯疏股使备滤（内选脑：甲叉丙烯酷融=29：1）7.5mN.N.NN-四甲基乙二股(TEMED)原液26%过竞股链现比现配
10XYBE缓冲液
加蒸水至45ml.。
k1.4显影液
竺绒化bzxz.net
硼氢化
. G mL.
溶于40mT.蒸馏水十，
11.5指示染料液液
40为鼎铺.5.93不一口苯蓝，
2样品制备
NYT401-2000
？.1研辨取0.5~.0?待检样品，加入2mL拍提短冲液，2mL月抽提缓冲滤剃和的断，少诈十二烧基载钟（SS）、1~满2-筑茎乙醇，到席，时设阴性对照、性对照。腔.2离心：加人2m氧伤-斤度醇21，1）.继续列宰2mi1/min离心15mi，改巢上清满。B2.3沉演：取上消液加入3mo1/酵酸钩性共终浓度为300mmol/八并入3倍依积95%的冷醇+冰路1h.1)0wu1/min高心15mim,收策沉流拍平。B2.4回溶：取用4mm.TBE经冲液辫解沉淀，各月：R3往遇电源
B3.1制拔：取洁净的电漆板，1光助脂过底，制成5%案丙随胶链胶恨。3.2加栏：取2部备的样品.加入5.指示染料液混勾后加人栏品推：3.3第一向电冰，止380电压下电深至二用本蓝距咬底约1时停止电源.B3.4第二可电诉：更换薪的电冰疑冲摘（75），交换正负极，在6SC通箱内，3BV电店下电冰至甲苯脱胶底约1cT1对将止电，取下胶染色：B4染色
4. 1后完,将效板在固定液1心%乙停、0.5火乙般1中固定15 mi或过夜。B4.2染色：在0.19乐的硝滴液1染么，0in，B4.3漂选，用蒸滴水源洗4次，每次3~5rmi1ltB4.4显影：在显彩液中显色11min.B4.5增色在、5g/I碳酸翊准中增色0mir，妆出胶板放人固烂随凸，测察结果。阳情判断，与阳性对思村向位明品当现的为叫生附录心
（标堆的附录）
反转录疑食酶链反应检测法
CF溶液配制
所用化学试制为分析纯级或格：C1.1校度热取餐冲液：100mmal/1化销.100anol/L1ris-HCl(pH9.)，10mmol/LEDTA，C.5%房,3.5%二烷米碳酸钠(SIS):1%22.醇C1.21×TAE冲依:0 mol/L个ri-HC.2Iol/LZ钠2muul/LEDTA[用冰Z调pH至8.0)
C1.3级冲液1：为含0.2地ol/L含化销的1TAE疑冲液。C1.1缓中液内含1.5m/.化链的1×AF缓冲液.C1.5XDNA第-台成签冲液;2a0 mmol;1 Tr%HClC1.61o×CR發冲液：1commol/L1ri-HClipla.3).5ommol/等化，15ommo/L每化袋0.1%生血活张立（BSA).
C1.了6%紊丙烯酰胺凝胶配方
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3F%雨烯研脑-平叉双丙烯酰致储备液（雨烯酰胺：日叉双丙烯耐胺一2911）9.（m]10~TAE级效
N,N.N',N\口中准之唤TEMED)原液心兴过疏载般（现月现配
加蒸调水至45m1.
C2板核酸(PSTVdRNA)的制备
U. UM5 ml.
. 4 al
取待检样品.5.~1.0R，生波氮山到磨，加?--3ml.核般提取数冲波妍磨浆，加等体积水恼和盼（内含0.1%9-羟就味).饿续研刘浆，再加等体积氛情，句浆.4七，800c--9000r/min离心15min-我游过1×mFAF舒维素注朱用缓冲减1过然比于，联月缓冲减1洗脱，年次加，特洗脱波有时乎款收策：自到洗脱液克到色为上，向洗脱波中入3倍体积的冷乙幕，-2它沉淀运夜,lna:-/min冷冻离心2G mir，取讯淀用元的之醇流涨，10 0n0 r/nin冷冻高心15min。收案链，上燥后，用C.1mL1XTAE缓冲液济解，良I为PS1Vd的接板核接样品，C3PCR扩塔
C1物P诚厅则为GGGTACGTCACAUT3，物22的碱序S'CCGAGCTCGGTOXAGGAGGTS
E3.2PCR节均方法
【3.2.1rDNA的会成
在.ml.心管icpendnr管中入：模板核腰1,10mol/补物1(μL.,菌量萨例5浴m，然中加入下混合物40/RNag1X第链合成波4,I0mmul/dNTPL../TT2l.U/LMMEV这录1rI水沿保温」::
C3.2.2PCR均
向05edo中以下试剂：的莱编水7l1C冲夜5mmol/引物
石婚汁夏兰，5C变任10min。然后入TaNA量合酶1，月PCR行扩增43ainC1mi725进行两话环片依:0s72最后效10min进行5款据并。
C4扩塔产物检测
C4.1.聚内希酰疫凝收电试
取活净的电泳报，1%的深脂封底：制放5光聚河烯酷胺凝胶极，2V~14(1V电漆至璃晰蓝走到胶底进止电脉：电泳假冲装为TAF缓冲接。4.2染色
C4.2.7定：将版在两定液%二，.5乐（酸中历是15min或过夜4.2.2英色在0.19%价酸银落减中染色20min.C4.2.3源洗：用带淘水选=次，等次5~5min，4.2.4显彩：在壶彩浓（等氧化销6.4g潮氧化的35mz，中醛1.riml..落400ml.蒸水）中显色16. mir.:
C4.2.5增色：在7.5/1，碳颜降液中色10min.取山跑极款入同定落中，观疾封果：1.2.6性学所，与生对联相固位置有期最常出现的为明性。6
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