【国家标准(GB)】 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验

中华人民共和国国家标准
鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物
微粒体酶试验
Salmonella typhimurium/mammalsmicrosomal enzyme test (Ames test)1主题内容与适用范围
本标准规定了Ames试验的基本技术要求。本标准适用于检测环境有害物质的致突变作用。2原理
GB 15193.4—94
鼠伤寒沙门氏菌的突变型（即组氨酸缺陷型)菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型（表现型），因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落形成数量，检查受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝勾浆(S-9)制备的S-9混合液。3仪器
3.1实验室常用设备。
3.2低温高速离心机，低温冰箱（一80℃）或液氮罐，洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，蒸气压力锅，匀浆器等。，
4培养基制备及试剂的配制
培养基成分或试剂除说明外至少应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过六个月，其他详见下述各培养基及溶液说明。4.1营养肉汤培养基
牛肉膏
胰陈(或混合蛋白陈）
氯化钠
磷酸氢二钾（K,HPO,·3H,O)
蒸馏水
加热溶解，调pH至7.4，分装后0.103MPa20min灭菌，普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。4.2营养肉汤琼脂培养基：用作a.基因型鉴定的结晶紫敏感试验，抗氨芙脊素和四环素试验，紫外线敏感性试验。b.细菌活力鉴定。琼脂粉
营养肉汤培养基
中华人民共和国卫生部1994-08-10批准1994-08-10实施
GB 15193.4-94
加热融化后调pH为7.4,0.103MPa20min灭菌。4.3底层培养基所需试剂及配制方法如下：4.3.1磷酸盐贮备液
磷酸氢钠铵(NaNH,HPO·4H,O）
柠檬酸(C.H.O·H,O)
磷酸氢二钾（K,HPO）
硫酸镁\(MgSO：7H,O)
加蒸馏水至100mL,0.103MPa 20min灭菌。注：1）待其他试剂完全溶解后再将硫酸镁缓慢放入其中继续溶解，否则易析出沉淀。4.3.240%葡萄糖溶液
葡葡糖
加蒸馏水至100mL，0.055MPa20min灭菌。4.3.31.5%琼脂培养基
琼脂粉
蒸馏水
融化后0.103MPa20min灭菌。
4.3.4底层培养基（无菌操作）
趁热（80℃），在灭菌琼脂培养基中(400mL)依次加入：磷酸盐贮备液
40%葡萄糖溶液
充分混勾，待凉至80℃左右时倒平皿，每皿（g90mm）25mL，37℃培养过夜以除去水分及检查有无污染。
4.4顶层培养基的成分及制备
4.4.1顶层琼脂
琼脂粉
氯化钠
加蒸馏水至
4.4.20.5mmol/L组氨酸-生物素溶液（诱变试验用）D-生物素（分子量244）
L-组氨酸（分子量155）
加蒸馏水至250mL。
4.4.3顶层培养基制备：加热融化顶层琼脂，每100mL顶层琼脂中加10mL10.5mol/L组氨酸-生物素溶液。混匀，分装在100mL三角瓶中，0.103MPa20min灭菌。用时融化分装小试管，每管2mL，在45℃水浴中保温。
4.5特殊试剂和培养基的配制
4.5.10.8%氨苄青霉素溶液（鉴定菌株用，无菌配制）称取氨苄青霉素40mg，用0.02mol/L氢氧化钠溶液稀释至5mL，保存于冰箱。4.5.20.1%结晶紫溶液（鉴定菌株用）称取100mg结晶紫，溶于100mL无菌水。4.5.3L-组氨酸溶液和0.5mol/LD-生物素溶液（鉴定菌株用）称取L-组氨酸0.4043g和D-生物素12.2mg，分别溶于100mL蒸馏水，0.103MPa20min灭菌，保存于4℃冰箱。
4.5.40.8%四环素溶液（用于四环素抗性试验和氨苄青霉素-四环素平板）552
GB 15193.4-94
称取40mg四环素，用0.02mol/L盐酸稀释至5mL，保存于4℃冰箱。4.5.5氨青霉素平板（用作TA97、TA98、TA100菌株的主平板）和氨苄青霉素-四环素平板（用作TA102菌株的主平板）每1000mL中由以下成分组成：底层培养基
磷酸盐贮备液
40%葡萄糖溶液
910 ml
组氨酸水溶液（0.4043g/100mL）0.5mol/L生物素
0.8%氨苄青霉素溶液
0.8%四环素溶液
四环素仅在使用对四环素有抗性的TA102 时加入。以上成分均已分别灭菌或无菌制备。4.5.6组氮酸-生物素平板（组氨酸需要试验用）每1000mL中由以下成分组成：底层培养基
磷酸盐贮备液
40%葡葡糖溶液
914 mL
组氨酸水溶液（0.4043g/100mL）10mL0.5mol/L生物素
以上成分均已分别灭菌。
4.5.7二甲基亚砜：光谱纯,0.103MPa20min灭菌。4.6S-9辅助因子(混合液试剂)的配制4.6.10.4mol/L氯化镁（MgCl.)溶液：称取3.8g，加蒸馏水稀释至100mL。4.6.21.65mol/L氯化钾(KCl)溶液：称取12.3g，加蒸馏水稀释至100mL。4.6.30.2mol磷酸盐缓冲液（pH7.4），每500mL由以下成分组成：磷酸氢二钠(NazHPO,)(14.2g/500 mL)磷酸二氢钠(NaH,PO,·H,O)(13.8g/500mL)调pH至7.4,0.103MPa20min灭菌或滤菌。440 mL
4.6.4辅酶-I（氧化型）溶液：准确称取辅酶-1，用无菌蒸馏水溶解配制成0..025mol/L溶液，低温保存(20℃以下)。
4.6.5葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液：称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用无菌蒸馏水溶解配制成0.05mol/L，低温保存（-20℃以下）。
4.710%S~9混合液的配制：每10mL由以下成分组成，临用时配制。磷酸盐缓冲液(0.2.mol/L,pH7.4)氯化钾溶液（1.65mol/L）
氯化镁溶液（0.4mol/L)
葡萄糖-6-磷酸盐溶液(0.05mol/L）辅酶-Ⅱ溶液（0.025mol/L)）
肝S-9液
混匀，置冰浴中待用。
5活化系统（S-9和S-9混合液）的制备6.0mL
用哺乳动物如大鼠，经诱导剂处理，取肝组织制备匀浆，9000g离心，上清液为S-9组分，与辅助成分以适当比例组成S-9混合液，用作试验中的代谢活化系统。5.1大鼠肝S-9的诱导和制备
GB15193.4-94
5.1.1选健康雄性成年SD或Wistar大白鼠，体重150g左右，周龄约5～6周。将多氯联苯（Aro-clor1254或国产PCB-五氯）溶于玉米油中，浓度为200mg/mL，按500mg/kg（体重）无菌操作一次腹腔注射，5d后断头处死动物，取出肝脏称重后，用新鲜冰冷的0.15mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加0.1mol/L.氯化钾溶液3mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于4000 r/min，往复1～2min），或组织匀浆器（200001/min，1min）中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。5.1.2将制成的肝勾浆在低温（0～4℃）高速离心机上，以9000g离心10min，吸出上清液为S-9组分，分装于无菌冷冻管或安中，每安2mL左右，最好用液氮或干冰速冻后置一80℃低温保存。5.1.3S-9制成后，经无菌检查，蛋白含量测定（Lowry法），每毫升蛋白含量应不超过40mg为宜，因过量蛋白将会抑制回复突变率，并经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后贮存于深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。
5.2S-9混合液配制
由S-9液和辅助因子（S-9混合液试剂）组成，辅助因子按Ames（1983）配方，低温（-20℃以下）贮存。混合液临用时新鲜无菌配制，或滤过除菌。一般按1：9配成10%混合液。用每Ⅲ0.5mLS-9混合液（含20～50μLS-9)测定其对已知阳性致癌物（诱变剂)的生物活性，确定最适用量，或者按一般用量，即每平Ⅲ0.5mLS-9混合液（含S-950μL）。S-9活性和用量应在报告中予以说明。6菌株及其鉴定和保存
6.1采用四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102、。TA97和TA98可检测各种移码型诱变剂；TA100可检测引起碱基对置换的诱变剂；TA102能检出其他测试菌株不能检出或极少检出的某些诱变剂，如甲醛、各种过氧化氢化合物和丝裂霖素C等交联剂。般用来测试受试物诱变性时，必须通过四个菌株的检测。必要时可增加TA1535，TA1537或TA104任一菌株。6.2菌株特性应与Ames试验标准相符（见表A1）。突变型菌的某些特性易丢失或变异，遏到下列情况应鉴定菌株的基因型：a.在收到培养菌株后；b.当制备一套新的冷冻保存株或冰冻干燥菌株时；c.当每血自发回变数不在正常范围时；d.当对标准诱变剂丧失敏感性时；e.使用主平板传代时；f.投入使用前。鉴定方法如下
6.2.1增菌培养：在5mL营养肉汤培养基中接种贮存菌培养物，于37℃振荡（100次/min）培养10h或静置培养16h备用。
6.2.2组氨酸缺陷型的鉴定
6.2.2.1加热融化底层培养基两瓶（一瓶不组氨酸，一瓶加组氮酸），不加组氨酸者每100mL底层培养基中加0.5mg分子D-生物素0.6mL；加组氮酸者每100mL底层培养基中加L-组氨酸（每100mL中含0.4043g）1mL和0.5mg分子D-生物素0.6mL，冷却至50℃左右，各倒两个平Ⅲ。6.2.2.2接种：取有组氮酸和无组氮酸培养基平Ⅲ各一个，按菌株号顺序各取一白金耳菌液划线（直线）接种在培养基表面，37℃培养48h。6.2.2.3结果：四株菌在有组氨酸培养基平Ⅲ表面各长出一条菌膜，无组氨酸培养基平皿上除自发回变菌落外无菌膜，说明受试菌株确为组氨酸缺陷型。6.2.3脂多糖屏障缺陷的鉴定
6.2.3.1加热融化营养肉汤琼脂培养基。6.2.3.2接种：取菌液0.1mL移入平，迅速将营养肉汤琼脂培养基（冷却至50℃左右）适量倒入平血，混匀，平放凝固。将无菌滤纸片一片放入已凝固的培养基平血中央，用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶紫溶液10uL，37℃培养24h，每个菌做一个平皿。6.2.3.3结果：阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带，说明存在rfa（深粗型）突变。这种变化允许某些大分子物质进入细菌体内并抑制其生长。TA97、TA98、TA100和TA102均有抑制带，野生型鼠伤554
寒沙门氏菌没有抑制带。
6.2.4R因子的鉴定
GB15193.4-94
6.2.4.1加热融化营养肉汤琼脂培养基，冷却至50℃左右，适量倒入平血中，平放凝固，用移液器吸0.8%氨芊青霉素10uL，在凝固的培养基表面依中线涂成一条带，待氨芊青霉素溶液干后，用接种环与氨苄青霉素带相交叉划线接种要鉴定的菌株，并且接种一个不具有R因子的菌株作氮芊青霉素抗性的对照（一个平皿可同时鉴定几个菌株），37℃培养24h。6.2.4.2结果：4个菌株经过24h培养，在氨苄青霉素带的周围依然生长不受抑制，即有抗氨芙青霉素效应.证明它们都带有R因子。6.2.5四环素抗性的鉴定
6.2.5.1用移液器各吸取5~~10μL0.8%四环素溶液和0.8%氨苄青霉素溶液，在营养肉汤琼脂培养基平皿表面依中线涂成一条带，待四环素和氮苄青霉素液干后，用接种环与四环素和氮苄青霉素带相交叉划线接种TA102和一种有R因子的菌株（作四环素抗性的对照），37℃培养24h。6.2.5.2结果：TA102菌株生长不受抑制，对照菌株有一段生长抑制区，表明TA102菌株有抗四环素效应。
6.2.6uvrB修复缺陷型的鉴定免费标准bzxz.net
6.2.6.1在营养肉汤琼脂培养基平血表面用接种环划线接种需要的菌株。6.2.6.2接种后的平皿一半用黑纸覆盖，在距15W紫外线灭菌灯33cm处照射8s，37℃培养24h。6.2.6.3结果：对紫外线敏感的三个菌株（TA97、TA98、TA100)仅在没有照射过的一半生长，具有野生型切除修复酶的菌株TA102仍能生长。6.2.7自发回变率的测定
6.2.7.1准备底层培养基平Ⅲ8个。6.2.7.2融化顶层培养基8管，每管2mL，在45℃水浴中保温。6.2.7.3在每管顶层培养基中，分别加入待鉴定的测试菌株的菌液0.1mL，一式二份，轻轻摇匀，迅速将此试管的内容物倾入已固化的底层培养基平皿中，转动平血，使顶层培养基均勾分布，平放固化，37℃培养48h计数菌落数。
6.2.7.4结果：每-一株的自发回变率应落在表A1所列正常范围内。6.3鉴定合格的菌种应保存在深低温（如一80℃）或加入9%光谱级DMSO作为冷冻保护剂，保存在液氮条件下（一196℃），或者冰冻干燥制成干粉，4℃保存。除液氮条件外，保存期一般不超过2年，主平板贮存在4℃，二个月后丢弃，TA102主平板保存两周应该丢弃。7受试物剂量、溶剂和特殊处理
7.1受试物最低剂量为每平血0.2ug，最高剂量为5mg，或溶解度允许，或饱和浓度，或对细菌产生最小毒性浓度，每种受试物在允许最高剂量下用4个（含4个）以上剂量，每剂量间隔不超过5倍，每个剂量应做三个平血，否则应说明选定剂量的理由。7.2溶剂可选用水、二甲基亚砜（每Ⅲ不超过0.4mL），或其他溶剂（毒性剂量以下）。无论选用什么溶剂均应无诱变性。
7.3若遐特殊样品作非常规处理时应在报告中说明。对以下几种情况可作如下处理：7.3.1含组氨酸样品：根据食品中测得的组氨酸含量若能诱发回变率的增高可加设组氨酸平行对照组；或将检品经XAD-I树脂柱过滤洗脱预处理。7.3.2食品包装材料及其制品成分：根据材料或制品的组成成分，可分别采取过筛抽提、蒸发残渣等技术处理。
7.3.3挥发性样品：可采用真空干燥器处理等方法。7.3.4天然植物材料：可按植物化学方法制备粗制品或纯制品。555
8方法和步骤
GB15193.4--94
可分为平板掺入法、预培养平板掺入法及点试法等，分别叙述如下：8.1平板掺入法
8.1.1增菌培养：取营养肉汤培养基5mL，加入无菌小三角瓶或无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌袜培养物接种于营养肉汤培养基内，37C振荡（100次/min）培养10h至对数增长期，每毫升不少于1～2×10°活菌数，培养瓶可用黑纸包裹，以防光线照射细菌。8.1.2底层培养基平Ⅲ若干个。
8.1.3融化顶层培养基分装于无菌小试管，每管2mL，在45℃水浴中保温。8.1.4在保温的预层培养基中依次加测试菌株新鲜增菌液0.1m，混匀，期受试物0.05~0.2mL（需活化时加10%S-9混合液0.5m1），再混匀，迅速倾入底层培养基上，转动平使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37℃培养48h观察结果。8.1.5另做一阳性对照和空白对照，不加测试物只加标准诱变剂（见附录A2.2，A2.3)或溶剂，如二甲基亚飙（光谱纯或分新纯），其他方法同上。8.2顽培养平板参入法：预培养对某些受试物可取得较好效果。因此可根据情洗确定，是香进行预培养。在加入顶层琼脂前，先进行以下预培养步骤：在试验中，将受试物（需活化时加人10%S-9混合液）和菌液，在37℃中培养20min，或在30℃中培养30min，然后再加2mL顶层琼脂，其他同上述平板掺入法。
8.3点试法
8.3.1与掺入法8.1.1相同。
8.3.2与掺入法8.1.2相同。
8.3.3与掺入法8.1.3相同。
8.3.4在水浴中保温的顶层培养基中依次加人测试菌株增菌液0.1mL（需要时加10%S-9混合液0.5mL），混匀，迅速倾人底层培养基上，转动平，使颜层培养基在底层上均匀分布。平放固化后取无菌滤纸圆片（直径为6mm），小心放在已固化的顶层培养基的适当位置上，用移液器取适量受试物（如10u），点在纸片上，戴将少量固体受试物结晶加到纸片或琼脂表面，37℃培养48h观察结果。8.3.5另做阳性对照和空白对照。将加受试物改加标准致突变物（见附录A2.1.A2.3)或溶剂（如二年基亚砜），其他步骤同上。
9结果的判定和报
9.1掺入法的结果判定：以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而定，如在背景生长良好条件下，受试回变菌落数增加一倍以上（即国变菌落数等于戴大于2乘以空白对照数），并有剂量反应关系或至少某一测试点有可复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物为诱变阳性。9.2点试法的判定：如在受试物点样纸片周围长出较多密集的回变菌落与空白对照相比有明显区别者，可初步判定该受试物为阳性，但应该用掺入法试验来确证。9.3结果报告：出报告时，阳性结果至少应做三次测试，阴性结果至少进行二次测试，才能对受试物作出判定。受试物的诱变性要用平板掺入试验来确证。报告中应注明实验条件和附上全部结果资料，对结果有疑义者需经统计分析，同一样品必须包括活化和非活化的结果，剂量单位为每平板微克，特殊例外。结果记录和报告格式见附录A3.1和A3.2。556
GB15193.4-94
附录A
菌株生物学特性鉴定标准、标准诊断性诱变剂、试验记录及报告格式（补充件）
菌株生物学特性鉴定标准、标准诊断性诱变剂、试验记录及报告格式A1
菌株生物学特性鉴定标准结果见表A1。表A1
组氨酸
“十”表示需要
组氨酸
脂多糖
屏障缺失
“十”表示抑制
标准诱变剂的测试结果及表示方法A2
R因子
抗四环素
（抗氨苯青霉素）
“+”表示具有
R因子
标准诱变剂在点试中的试验结果见表A2。A2.1
柔毛霉素
叠氮钠
ICR-191
丝裂霉素 C
2,4,7-三硝基萄酮
4-硝基-磷苯撑二胺
4-硝基喹啉-N-氧化物
甲基磺酸甲酯
敌克松
2-乙酰胺基荡
黄曲霉毒素 Bt
甲基硝基亚硝基胍
pg/片
注：每血回变菌落数（扣除自发回变)的符号：S-9
“十”表示有四
环素抗性
修复缺陷
“+”表示无修
复能力
20～100; ++
自发回变
菌落数
90~180
120~200
240~320
100~200:+++
500;++++
GB15193.4-94
>500。案毛霉素和聋氮钠溶解在水中，其他斯有化合物溶解在DMSO中。用PCB诱导的大鼠S-9(20Ml./ⅢL)活化2-AF。柔毛每素在点试中产生最低效应，应作平板掺入试验（见表A3)。ICR-191-甲氯基6氧代-9-[3-（2-氟乙基）氮基丙胺】吖·2盐酸;inh因诱变剂毒性引起的生长抑制。诊断性诱变剂在平板掺入中的测试结果见表A3。A2.2
柔毛家
叠氮钠
ICR-191
丝裂霉索 C
2,4,7-三硝蒸荔铜
4-硝基-磷-苯撑二胺
4-硝基喹啉-N-氧化物
甲基磺酸甲醛
敌克松
2-乙烯氨基萄
苯并(a)芪
每皿回
注：所列数值代表his+回变菌落数值，取自剂量反应的线性部分，对照值已扣除，用PCB诱导的大鼠肝S-9(20μL./IL）活化2-AF和并（a）芪。inh：指链黑霉素在无群性范围（小于0.25μg）内没有检出诱变性，每0. 005 μ在 TA100引起的画变菌落数小于 70+丝裂霉紊对 uVrB菌株是致命的。A2.3推荐用于点试和掺入平板的标准诱变剂见表A4。A4
敌克松
2-氨基荔
敌克松
2-氮基
敌克松
2-氨基荔
敌克松
2-氨基荔
叠氰钠
2-氨荔
叠氮钠
2-氨基萄
敌克松
敌克松
3Ames试验报告
送样单位
送样日期
GB15193.4-—94
样品名称(中文)
方法：（常规平板掺入、预培养、点试、其他）菌株
试样最小毒性剂量
溶剂及量
蛋白含量
结果：
空白对照
溶剂对照
阴性对照
生物学性状
溶解度
S-9来源
(英文)
Ames试验点试法、掺入法结果1）表A5
=sg +s9
注：1）点试法结果为每血回变菌落数，用符号表示；掺入法结果为每Ⅲ回变菌落数(X士SD)。结论：
检测单位名称：（盖章）
附加说明：
本标由卫生部卫生监督司提出。本标准由卫生部食品卫生监督检验所、北京医科大学、浙江医科大学负责起草。本标准主要起草人戴寅、丁兰、金钟初、郭世萍。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。月
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。