【国家标准(GB)】 骨髓微核试验

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骨髓微核试验
Micronucleus test of hone marrow cell1主题内容与适用范图
本标规定了微核试验的基本技术要求。本标准适用于检测环境有害物质的致突变作用。2原理
G 15193.5-94
微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。这种情况的出现往往是由于受到染色体断裂剂作用的结果。另外，也可能在受到纺經体毒物的作用时，主核没有能够形成，代之以一组小核。此时小核往往比般典型的微核稍大。
3试剂和材料
全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。3.1小牛清
小牛血清滤菌后放入56℃恒温水浴保温1h进行灭活。通常储存于4℃冰箱冰盒里。亦可用大、小鼠血清代替。
3.2 Giensa 染液
称取Giemsa染料3.8g，加入375mL甲醇（分析纯）研磨，待完全溶解后，再加入125mL甘油，置37C恒温箱保温48振摇数欢。过滤满周后用。3.3Giemsa应用液
取1份Giemsa染液与6份磷酸盐缓冲液混合而成。临用时配制。3.41/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8)磷酸二氢钾（KH2PO）
磷酸氢二钠(NaHPO。·12H2O)
加蒸馏水至
3.5甲醇（分析纯）。
3.6解部器械，生物微镜，载玻片等。4，实验动物
1000mL
小白鼠是微核试验的常规动物，也可选用大白鼠。通常用7～12周龄，体重25～30g的小鼠或体重150~~200多的大鼠。每组用两种性别的动物至少各5只。中华人民共和国卫生部1994-08-10批准560
1994-08-10实施
5剂量分组
GB15193.5-94
原则上以动物出现严重中毒症状和/或个别动物出现死亡为最高剂量。一般可取1/2LD50。慈性毒性受试物最大给子量无死亡时，则以受试物最大给子量或5g/kg体重为最高剂量，以下设3～5个剂量组。另设溶剂对照组和阳性对照组。阳性对照物可用环磷酰胺40mg/kg体重经口给予。6操作步骤
6.1标本制备
经口灌胃。根据细胞周期和不同物质的作用特点，可先做预试，定取材时间。带用30h给受试物法。即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱白处死动物。取胸骨或股骨，用止班钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片。或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后放入甲醇中固定5～10imin。当日固定后保存。将固定好的涂片放入Giemsa应用液中，染色10～15min。立即用pH6.8的磷酸黏缓冲液或蒸馏水冲洗。晾干。写好标签，干燥器中保存。6.2阅片
选择细胞完整、分散均勾，着色适当的区域，在油镜下观察。以有核细胞形态完好作为判断制片优劣的标准。
本法系观察嗜多染红细胞的徽核。用Giemsa染色法，嗜多染红细胞呈灰燕色，成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20~1/5。
用双盲法阅片。每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示。
观察嗜多染红细胞与成熟红细胞（PCE/RBC），可作为细胞性指标之一。般计数200个嗜多染红细胞。
7数据处理
一般采用卡方检验、泊松分布、或双侧t检验等统计方法进行数据处理，并按动物性别分别统计。8结果评价
试验组与对照组相比，试验结果微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上有显著性差别，但无剂量反应关系时，则须进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由卫生部食品卫生监督检验所、中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、浙江省卫生防度站负责起草。
本标推主要起蕈人徐凤丹、帮驰、赵硕。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。361
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