【国家标准(GB)】 公共场所茶具微生物检验方法大肠菌群测定

GB/T18204.3—2000
为贯彻执行《公共场所卫生管理条例》和GB9663～9673-1996，GB16153—1996《公共场所卫生标准》，加强对公共场所卫生监督管理，特制定本标准。本标准中的方法是与GB9663～9673一1996，GB16153--1996相配套的监测检验方法。本标准第一法为仲裁法。
本标准为首次发布。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准起草单位：江苏省卫生防疫站、中国预防医学科学院环境卫生监测所、北京市卫生防疫站。本标准主要起草人：封幼玲、符晓梅、杭方双、周淑玉、高晖。中华人民共和国国家标准
公共场所茶具微生物检验方法
大肠菌群测定
Methods of microbiological examination for tea set in public places---Determination of Coliform bacteria1范围
本标准规定了公共场所茶具大肠菌群的测定方法。本标准适用于公共场所内公用茶具大肠菌群的测定。2定义
本标准采用下列定义。
GB/T18204.3-2000
大肠菌群coliformbacteria
指一群在37℃、24h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为类便污染指标来评价被检物的卫生质量。3仪器
3.1高压蒸汽灭菌器。
3.2干热灭菌箱。
3.3培养箱：36℃士1℃。
3.4水箱。
3.5电炉。
3.6天乎。
3.7灭菌平Ⅲ：直径9cm。
3.8灭菌刻度吸管：1mL，10mL。3.9灭菌棉拭子。
3.10灭菌剪刀。www.bzxz.net
3.11pH计或精密pH试纸。
4培养基和试剂
4.1乳糖胆盐发酵培养液
4.1.1成分：蛋白陈
猪胆盐（或牛、羊胆盐）
0.04%溴甲酚紫水溶液
蒸馏水
国家质量技术监督局2000-09-30批准20g
1000mL
2001-01-01实施
GB/T18204.3—2000
4.1.2制法：将蛋白陈、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH至7.4.加溴甲酚紫溶液，混匀，分装到带有倒管的试管中，每管10mL。以115℃高压灭菌15min。注双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他效分加倍。4.2伊红美蓝琼脂
4.2.1成分：蛋白陈
磷酸氢二钾
2%伊红水溶液
0.65%美蓝溶液
燕馏水
1000mL
4.2.2制法：将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调pH至7.1，分装到烧瓶内。121℃高压灭菌15min备用，临用时加人乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加人伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。4.3乳糖发酵管
4.3.1成分：蛋白陈
0.04%溴甲酚紫水溶液25mL
蒸馅水
1000mL
4.3.2制法：将蛋白陈及乳糖溶于水中，调pH至7.4，加人指示剂，分装到带有倒管试管中，每管3mL，115℃高压灭菌15min。
4.4苹兰氏染色液
4.4.1结晶紫染色液：
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
将结晶紫溶于乙酵中，然后与草酸铵溶液混合。4.4.2革兰氏碘液：
碘化钾
蒸馏水
将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。4.4.3脱色液：
95%乙醇
4.4.4沙黄复染液：
95%乙醇
蒸馏水
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。4.5染色法
4.5.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1min，水洗。4.5.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。4.5.3滴加95%乙醇脱色，约30s，水洗。4.5.4滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。10
4.6染色结果
GB/T18204.3-2000
革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。4.7大肠菌群快速检验纸片
4.7.1质要求：纸片必须符合食（饮）具用大肠菌群快速检验纸片质量标准。4.7.2质量标准：每张纸片5cm×5cm，pH值7.0~7.4，包装无菌，生产厂家经卫生部门审核认可。5检验程序
大肠菌群检验程序如下：
双料乳精胆盐发酵管
36℃±1c
不产酸，不产
大肠菌群阴性
产酸、产气
伊红美蓝琼脂平板
36℃±1℃
草兰氏杂色
草兰氏阳性
大肠菌群明性
6操作步骤
6.1采样方法
革兰氏阴性无芽跑杆菌
18~24h
乳精发醇管
36C±1c24h
产酸产气
大肠菌群阳性
6.1.1随机法：随机抽取清洗消毒后准备使用的茶具。6.1.2涂抹法：使用测定细菌总数时采集的样品，无需重采。不产酸，不产气
大肠菌群阴性
6.1.3纸片法：用灭菌生理盐水湿润5cm×5cm大肠菌群快速测定纸片两张，分别粘贴在茶具内、外缘口唇接触处，约30s后取下，置于无菌塑料袋内。6.2检验方法
6.2.1发酵法
6.2.1.1用测定细菌总数剩余的检样，倒例人双料乳糖胆盐发酵培养液中。置36℃士1℃培养箱内培养24h。
6.2.1.2观察是否产酸、产气，若有变黄和气体产生，该管推测性检验阳性。6.2.1.3如不产酸、不产气则为大肠菌群阴性。6.2.1.4自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，转种伊红美蓝琼脂平板上，置36℃C士1℃培养箱培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实性试验。GB/T18204.3—2000
6.2.1.5在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行染色镜检：同时接种乳糖发酵管，置36℃±1℃培养24h。
6.2.2纸片法
将已采样的纸片置36℃土1℃培养箱内培养1618h，观察结果。7结果报告
7.1发酵法
凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告检出大肠菌群。7.2纸片法
纸片保持紫蓝色不变，则报告为大肠菌群阴性；纸片变黄，并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕，则报告检出大肠菌群。
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