【国家标准(GB)】 蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法

GB/T 18089--2000
蓝舌病(BIU)是--种绵羊、牛、山羊等反鱼动物的严重传染病，可通过检测血清中抗体的存在，确定动物是否感染本病。按国际上通常的方法，琼脂免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验用于蓝舌病的定性，血清中和试验用于蓝活病的定型。本标准根据国际常用的方法和我国多年的实践，采用鸡胚静脉接种是最为敏感、实用的病毒分离方法。
蓝舌病病毒分离物可通过免疫荧光试验进行定性鉴定；用病毒中和试验进行定型鉴定。本标准是在参考美国、澳大利亚实验室的检测规程和总结我国在这一领域多年研究和实践经验的基础上制定。
本标准的附录A是标准的附录。
本标准由农业部提出。
本标准起草单位：中华人民共和国昆明出入境检验检疫局。本标准主要起草人：石世压、张晓丁、徐自忠、徐维加、周晓黎。96
1范围
中华人民共和国国家标准
蓝舌病微量而清中和
试验及病毒分离和鉴定方法
Micro-serum neutralization test,virus isolation andidentification for bluetongue本标准规定了蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法。GB/T18089---2000
本标准适用于动物感染蓝舌病病毒后中和抗体的检测及病毒分离和鉴定。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法（eqvIS）3696：1987）3缩略语
3.1CPE致细胞病变作用。
3.2TCIDm半数组织培养感染量。3.3BI.P乳糖蛋白陈缓冲肉汤。
3.4SPF无特定病原体。
4原理
4.1血清中和试验原理
特异性的血清中和抗体与病毒结合后，能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，而且还表现在中和一定量的病毒，必须有-一定效价的免疫血清。中和试验以测定病毒的感染力为基础，必须选用对病毒敏感的细胞、动物或鸡胚为实验材料，中和抗体滴度的判定以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据。蓝舌病病毒感染动物后，7天左右出现中和抗体，中和抗体具有高度的型特异性，因此，可通过中和试验对蓝舌病病进行定型鉴定。
4.2病毒分离及鉴定原理
动物感染蓝舌病病毒后4天左右出现病毒血症，羊的病毒血症持续4周左右，牛的病毒血症持续8周左右，病毒主要存在于动物的红细胞内、并能从精液排毒。在动物病毒血症期，可从其血液、精液和脏器分离到病毒。用特异性荧光抗体做直接免疫荧光试验可对分离藓进行定性鉴定，用色知标准阳性血清做病毒中和试验可对分离毒进行定型鉴定。国家质量技术监督局2000-04-26批准2000-10-01实施
5试剂和材料
GB/T18089—2000
本标准所用水应符合GB/T6682中三级水（三蒸水)的规格本标准所用试剂配方见附录A（标准的附录）。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。5.1病毒：蓝舌病病毒1～24血清型国际标准毒株，由国际兽疫局蓝舌病参考实验室提供，5.2对照血清：蓝舌病标准阳性血清、阴性血清，由国际兽疫周蓝舌病参考实验室提供或者按国际兽疫局规定的方法制备及认定。
5.3被检血清。
5.4细胞：C6/36、BHK2i或Vero。5.5培养液：199培养基中加10%无蓝舌病病毒抗体的胎牛血清（经56C、30min灭能），含青霉素200IU/ml.、链霉素200μg/mL。
5.6维持液和稀释液：199培养基中加2%无蓝舌病病毒抗体的胎牛血清，含青霉素200IU/mL、链霉素 200 μg/ml。
5.7细胞分散液、液体石蜡、乳糖蛋白陈缓冲肉汤（BLP)、碳酸缓冲甘油、0.01mol/LPBS(pH=7.2)。5.8荧光标记的蓝舌病病毒抗体。5.9 10～11 日龄SPF 鸡胚。
6器械和设备
6.1鸡胚开孔器、照蛋箱或照蛋灯、乳钵或组织捣碎器、擦镜纸。6.2超声波裂解器、倒置显微镜、荧光显微镜。微型振荡器、二氧化碳培养箱、孵化器、冰箱（一20C保荐血清，一70℃保存种毒）。
6.396孔组织培养板，单头和多头微量移液器（20～200μl.)及滴头。7蓝舌病微量血清中和试验
7.1病毒繁殖
将蓝舌病病毒1~~24(BI.UV1~24)血清型分别接种BHKz或Vero细胞单层，37C吸附1h后加入维持液，置5%二氧化碳培养箱于37℃培养，接种24h后逐日观察。待CPE达75%以上，收获病毒培养物，冻融1次或置冰浴中用超声波处理（40uA、1min），2000r/min离心20min，分装小瓶，每瓶1mL，置·-70℃保存备用。
7.2毒价测定
将各型病毒在96孔板上作10°～10-10稀释，每个稀释度作8孔，每孔病毒悬液为50μL，加入细胞悬液100uL（3×105个细胞/ml），每块板设8孔细胞对照。置5%二氧化碳培养箱于37℃培养，从72～168h逐日观察记录CPE。按Karber方法计算出各型病毒的TCIDso/50μL。7.3试验程序
7.3.1蓝舌病标准阳性血清、阴性血清、被检血清经56℃30min灭能。7.3.2对照设立
-…细胞对照：设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液100μL（3×105个细胞/mL）、稀释液100μL.
一阴性对照：设4孔阴性对照，每孔加阴性血清和100TCID50/50μL病毒悬液各50μI.，再加入细胞悬液100μl(3×105个细胞/mL)。病毒回归对照：将各型病毒稀释成1000、100、10、1TCID50/50ul.，每个稀释度作4孔，每孔加入病毒悬液50μl，再加入细胞悬液100μl（3×10°个细胞/ml），每孔补充稀释液50μl。98
GB/T 18089—2000
-阳性对照：将阳性血清分别作1：4、1：8、1：16稀释，每个稀释度作4孔，每孔加各稀释度阳性血清和100TCID50/50μl病毒悬液各50μL，再加入细胞悬液100μL（3×105个细胞/ml）。-血清毒性对照：每份被检血清须按稀释度各设孔毒性对照，每孔加各稀释度血清50μL，稀释液50μl.和细胞悬液100μl（3×10″个细胞/mL）。7.4中和试验
7.4.1将每份被检血清作1：4、1：8、1：16稀释，每个稀释度作5个孔，每孔加各稀释度血清50μl.。7.4.2第1孔作为血清毒性对照，加入稀释液50μl.和细胞悬液100μl（3×103个细胞/mL）。7.4.3第2~～4孔为正式试验孔，每孔加入病毒悬液50μl（100TCID5/50μL）振荡3～5min；置37（中和1h，加细胞悬液100uL（3×105个细胞/ml.）。7.4.4置5%氧化碳培养箱于37C培养7天，24h后逐日观察CPE并进行记录。7. 5结果判定
当病毒对照在100～300TCIDs/50μL出现CPE，阳性、阴性、正常细胞、血清毒性对照全部成立时，才能进行判定。判定时间为72～168h。被检血清孔50%出现保护判为阳性，低于50%判为阴性。当某份血清的某-稀释度出现50%或50%以上保护时，该血清稀释度即为该份血清的中和抗体滴度。当中和抗体滴度1：8时判为阳性。试验结果记录：bzxz.net
出现（PE记为：十；
无CP记为：一。
8蓝舌病病毒分离
8.1样品
肝素抗凝血（每5mL血液用10IU肝素）、脏器（脾、肝、肾、淋巴结）、精液、库螺。用于病毒分离的样品须置冷藏容器保存，在24h内送到实验室，并立即进行处理。8.1.1血液样品制备
取肝素抗凝血5ml，用PBS洗涤血样3~~4次，每次2000r/min离心10min，弃上清液后加入倍量BI.P，置冰浴中用超声波处理（40uA、1min）后，经处理的样品当天使用，使用前置4C保存，剩余样品置一70C保存备用。
8.1.2组织样品制备
无菌采集动物脾、淋巴结、肝、肾各5g，剪碎后加入BIP10ml.（含青霉素2000IU/mL、链霉素2000μg/ml.），置乳钵中研磨，置4C冰箱浸提4h，取上清液5mL用超声波裂解处理（100uA、1~2min）或冻融二次，3000r/min离心20min，取上清液使用，使用前置4C保存，剩余样品置一70℃保存备用。
8.1.3精液样品制备
取精液样品1ml，取0.5mL用BLP作1：5稀释后，3000r/min低温离心20min，弃上清液，再用BLP作1：5稀释，充分混匀，置冰浴中用超声波处理（100uA、1～2min），3000r/min离心20min，取上清液使用，使用前置4C保存，剩余样品置一70C保存备用。8.1.4库螺样品制备
取200～300个库螺盛于小试管中，加入含青霉素2000IU/ml.、链霉素2000μg/ml.的BLP3～5mL，解冰浴中研磨虫体，3000r/min离心20min，取上清液使用，使用前置4C保存，剩余样品置-70C保存备用。
8.2鸡胚静脉接种
8.2.1选择10~~11日龄发育良好的SPF鸡胚，在照蛋灯.上标记静脉位置和开孔区，用开孔器开窗备用。
GB/T 18089—2000
8.2.2在无菌条件下，每份样品接种5个鸡胚，每个鸡胚接种0.1mL，接种后用擦镜纸封口，置33.5（培养。
8.2.3逐日观察并记录，48h内死亡的鸡胚为非特异性死亡，将48h后死亡的鸡胚收置4C冰箱保存，于接种后第6天同未死亡鸡胚一一起收毒。8.2.4收毒：在无菌条件下，用碘酒、酒精棉球对鸡胚气室处进行消毒，凿开蛋壳，按常规方法剪破壳膜、尿囊膜、羊膜后，取出胚体，置平血中，在每个胚体上取若干组织块（有病变时，取病变组织），置组织捣碎器或乳钵中研磨后，按1：5加入BLP（含青霉素2000IU/ml、链霉素2000μg/mI），置4℃冰箱浸提4h，当日使用，剩余样品置一70℃保存备用。8.3接种敏感细胞育传
8.3.1按常规方法制备（C6/36细胞单层。8.3.2将收获的鸡胚上清液，接种细胞单层，每份病料接种两管，每管接种0.1ml，置25℃培养，第二天换液后，培养7天。
8.3.3按常规方法制备BHK，或Vero细胞单层。8.3.4第7天用吸管吹下被接种的C6/36细胞。8.3.5将吹下的Cs/3细胞悬液接种于BHK，或Vero细胞单层，37C吸附1h后，加入维持液置37C培养，24h居逐日观察细胞病变，连续观察7天。9蓝舌病病毒鉴定
9.1荧光抗体试验（直接法）
9.1.1将接种的BHK2或Vero细胞培养物冻融一次，1000r/min离心10min，取上清液接种于带有玻片的21孔组织培养板的BHK2或Vero细胞单层。每份样品接种两孔，同时设阳性、阴性对照，37C吸附1h后加入维持液，置37℃培养72h。9.1.2取出培养板中的玻片，用0.01mol/LPBS漂洗一次，预冷丙酮固定15min。9.1.3每片滴加荧光标记的蓝舌病病毒抗体，使其覆盖于玻片，置暗湿盒中于37℃作用30min。9.1.4用0.01mol/L.PBS洗片三次，再用蒸馏水洗片次。9.1.5风干，用碳酸缓冲甘油封片，荧光显微镜检查。9.1.6结果判定：在阳性对照细胞浆内呈现颗粒状的黄绿色荧光，阴性对照应无荧光或无特异性荧光时，细胞浆内发现颗粒状的黄绿色荧光者即可判为阳性。9.2病毒中和试验
9.2.1病毒繁殖：收获在BHK。或Vero细胞上出现CPE的病毒悬液，复壮一代，待CPE达85%以_上，收获病毒培养物冻融1次，2000r/min离心20min，分装置一70℃保存备用。9.2.2毒价测定：方法同蓝舌病微量血清中和试验。9.2.3按Karber方法计算出TCID5o/50μL，用100TCIDso/50μL蓝舌病病毒分离毒株分别与不同血清型的蓝舌病病毒标准阳性血清（效价不低于1：32)作微量中和试验。9.2.4试验在96孔组织培养板上进行，阳性血清、阴性血清经56℃30min灭能。各型阳性血清作1：10稀释。
9.2.5操作步骤
9.2.5.1对照设立
*一细胞对照：设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液100μl（3×105个细胞/mL）、稀释液100μl.
阴性对照：设4孔阴性对照，每孔加阴性血清和100TCIDso/50μl病毒悬液各50μI，再加入细胞悬液100μL(3×105个细胞/ml.）。·病毒回归对照：将被鉴定病毒稀释成1000、100、10、1TCIID5/50μL，每个稀释度作4孔，每孔100
GB/T18089—2000
加入病毒悬液50μL，再加入细胞悬液100μL（3×105个细胞/mL），补充稀释液50μl。9.2.5.2正式试验
每个血清型作4孔，每孔加1：10稀释的阳性血清和100TCIDsc/50μl.病毒各50μl，振荡3～5min，置37℃中和1h，加入细胞悬液100ul（3×105个细胞/ml.）9.2.5.3结果判定
按照蓝舌病微量血清中和试验方法7.5进行判定：判定时间从72～168h。经1：10稀释的蓝舌病某型标准阳性血清能与病毒中和，使50%以上的细胞不出现CPE者判为阳性，即为所鉴定病毒的血清型。
GB/T18089
9-2000
附录A
（标准的附录）
溶液配方
A1营养液：199培养基，加入含10%无蓝舌病病毒抗体胎牛血清；抽滤除菌。A2维持液：199培养基，加入含2%无蓝舌病病毒抗体胎牛血清；抽滤除菌。A3细胞分散液：
乙二胺四乙酸二钠（EDTA）
无钙镁PBS
抽滤除菌
A4乳糖蛋白陈缓冲肉汤（BILP）a）磷酸二氢钠（无水）
三蒸水
b）Na.HPO（无水)
三蒸水
工作液：
蛋白陈
10磅15min高压灭菌或抽滤除菌。0. 01 mol/L, PBS pH7. 2~7. 4A5
磷酸氢二钠
磷酸二氢钠
氯化钠
蒸馏水
碳酸缓冲甘油
a）0.5mol/l.pH9.5碳酸缓冲液
碳酸氢钠
碳酸钠（无水）
蒸馏水
b）甘油
1 000 ml.;
500ml.。
1 000 ml;
220mL;
1 000 ml.
100ml.。
1份碳酸缓冲液加9份甘油混合即成。注：实验所用试剂除有特殊规定外，均需高压灭菌。102
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