【农业行业标准(NY)】 猪痢疾诊断技术

ICS 11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T545.-2002
猪痢疾诊断技术
Diagnostic technigues for swine dysentery2002-08-27发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T 545-2002
猪制疾是危害严重的猪疫病。猪痫炭（swinetlysente:ty简称SD)是·种严重的粘液性出血性腹病，是猪特有的一种慢性或急性肠道传染病。厌氧性猪痫疾蛇样螺旋体（Serpreinahyodysenteriu写Sh)为SL)病原，而肠道其他灰氧菌可加剧病情。本病在流行病学、临诊症状、病理变化等方面具有一定的特征性，是综合性诊断不可缺少的部分.仙本病的确实诊断应依据从大肠或粪便中分离出Sh才能进行定性。在取得培养结果前，新筛粪便或大肠粘膜及其内容物抹片镜检Sh也是一种实用的辅助于段本标推的渐录A、附录B均为规范性附录。本标推由农业部畜牧兽医周提出。本标推出全国动物检疫化技术委员会归口。本标雅起草单位：山东农业大学、农业部动物检疫所。本标推主要起草人：崔喜顺、尹博、徐海花、蒋正军、郭福生、肖传发。364
1范围
猪痢疾诊断技术
本标准规定广猪痫疾（SI>)诊断的技术要求，本标准适用于猪剃疾的诊断。
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本标推所规定的粪便中猪疾蛇样螺旋体（Sh）显微镜检查不适用于急性病例厉期、俊性或隐性及投药后病例。
本标准畅致病性试骑中结肠结扎试验可根据条件选做.2流行病学
2.1猪捌疾在白然流行中只发生于猜。各种午谢，品种、性别的猪皆可发摘+但幼猪(1.5~4月龄)最多见、而哺乳仔猪，成年猪发病较少。2.2本病主要经消化道感染。各种应激因紊,阴雨潮湿，气候多变,均可促进本病发生。2.3本病无季节性，常呈缓慢传播，且流行持续期长，多数病猪转为慢性，康复后（白然康复或治疗店）可复发或多饮复发。
3临诊症状
3. 1 游伏期:2 日至 2 个月以上,一般为1 ~2周3.2最急性：多见于爆发本病之，表现急性剧烈腹泻,排便失禁，呈高度脱水状态而迅速死。病程12 h--- 24 h.
3.3急性：病斥始多为排软粪或稀粪，随即粪中山现大星粘液和血羧（凝块)，呈油脂样蛋清样或胶冻状，粪负为探色，红色或熙红色不等，病猪迅速消瘦，常转为慢性或死亡。病程1~2周3.4．亚急性或慢性：粘液出血性下翔时轻时重，生长发育停潴，常呈恶病质状态。部分康复猪经一定时间可以复发，病程4周以上。
3.5本病用抗菌药物和对症治疗，可获脏床治愈效果,亦为诊断本病的一个佐证。4病理变化
4.1土要病变见于大肠,其他组织器官均尤特征性病变，4.2尽期病变常出现在结肠模项部，随病情进一步发展可以费延至自肠，整个结肠和直肠前设。急性病例表现为粘液性、出血性和纤继紊性渗出，肉眼可见大肠粘膜充血、肿服和出血，并有胶陈样附着物，带混有血液和纤维紊。严重时，粘膜表面有散在性或弥散性糠麸样或干酪样坏死物覆盖，刮去后露出不规则廉烂山血溃疡面。
5便中Sh显微镜检查
5.1材料准备
5.1.1器材：显微镜。暗视野镜头，玻片及盖玻片，酒精灯等。5.1.7染色被：结晶紫染色液（革兰氏染色第一液)或稀释的石炭酸复红。5.1.3样品：病猪新鲜粪便（含粘液)或直肠拭子或人肠内容物及粘膜。365
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5.2操作方法
5.2.1染色样品制作：联样品少许直接抹片，燥火焰固定、以结晶紫波或稀释复红染色min~3min水洗，吸卡后待检，
5.2.2总滴样品制作：取样品少许悬于少生理盐水中，作成悬滴样品后待检。5.2.3每份样品最少制片2张。Www.bzxZ.net
5.2.4显微镜检优：染色样品以油镜直接观察.滴样品在暗视野（或喷光)400倍1(100倍头下观察。
5.2.5每片样品至少观察10个规野。5.3结果判定
典型Sh菌体长6putm-8.5um，呈2个~5个疏螺旋状，两端尖锐，呈蛇样活泼运动（暗视野）。当视野中有数量较多（3条~-5条以上)Sh样菌体时（见图1），在获墙养结果前，可作为诊断的重要参考依据。
注：肉中小李曲菌为李杆菌。
图1病猪粪便中的猪疾蛇样螺施体6大肠组织中 Sh 显微镜检查
6.1材料准备
6.1.1器材：切片机，显微镜，染色缸上，盖玻片，水浴锅，温箱等。6.1.2试剂：福尔马林，95%及100%酒精，二甲苯，切片石蜡，结晶紫樂色液，姬姆萨氏染色液、蛋清等。
6. 1. 3 样品:有病变人肠-
6.2操作方法
6.2.1大肠组织切片样品制作
6.2.1.1分别切取小块(1cm)样品（育畅、结助和直肠前段）置10%福尔马棘中至少阔定3h~4h。6.2.1.2取出样品用流水冲洗1h,6. 2. 1. 3置样品下 39 C的 95%满精(三缸)及无水酒精中,各脱水 30 min。6.2.1.4将脱水后样品放人38元甲苯中（二缸）.各10min~15min透明。6.2.1.5取透明样品放人等量56℃二甲苯蜡10min：再放人561：3二币苯石蜡20min：然后放人6C行蜡.30min-60min进行浸蜡包埋。6.2.1.6切片贴片置56C2h~~3h或3%（腿箱F过侵烘十，备染。6.2.2切片样品染色
6.2.2.1划片样品放人-中举（二缸）各3min--5min脱蜡。6.2.2.2先置人纯酒精，再依次留人95%酒精、70酒精各2min～3min+水洗。6.2.2.3以结品紫液没染脱蜡后的切片样品3min~-5min，水洗，干燥，二甲苯透明，封片，备枪。36
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或以10倍稀释的姬姆断染液授染脱蜡切片样品8h~-21h，再迅速通过两缸纯酒精，干燥，二甲苯透明.封片·备检
6. 3结果判定
国2病猪结肠腺窝内猪薄疾蛇样螺施体以400倍~～100门倍镜头观察，可在粘膜表面特别是在腺窝内可见到聚集不同数量的Sh 样菌体，多时密集如网状（见图2），具有重要诊断价值，7猪喇疾蛇样螺旋体分离培养和鉴定7.1材料准备
7.1.1器材：氧培养装督及使用方法见附录A，细菌学实验带规器材，外科手术器材，微孔滤器和0. 养5 um滤膜。
7.1.2试验动物：幼猪(:kg~-25kg)或豚鼠(3周~4.周龄)或幼小(20g左右)。7. 1.3试剂:磷酸就缓冲液(P35>0. 01 mol/Lpl17.2,生理盐水,多粘闲素培养基胰可陈血液琼脂（TSA能制万法见附录B：
7.1.4样品：病猪新鲜粪便或大肠粘膜刮取物（含粘液)。对死猪或扑杀猪大肠(言畅、结及直肠前段)分段结扎(每段1r:m),离取出。样品应尽早作分离培养，也可在0C:4℃保存4d～7d，7.2操作方法
7.2.1样品中Sh镜检
将样品少许抹片染色或作成怒满标本，镜检，观察Sh有无活力。含菌量少且无活力者，则以分离成功。
7.2.2分离培养
7.2.2.1直接划线分离法：即取样品直接在TSA（见附录B)上划线接种荐干血。7.2. 2.2集菌法:先将样品以生理盐水或 PBS 作 1 5稀释,2 000 r/min离心10 min,弃去沉淀：将 卜消液再以600tr/min~~8000 t/mit离心20min。取淀物划线接种TsA署干血，7.2.2.3稀释法：将样品或集菌法的沉淀物作10倍梯度稀释至10**~10，取各梯度稀释液各1滴，分别划线接种于TSAT（每梯度稀释液最少接种3血）。接种后的培养暨厌氧罐内进行厌氧培养（见附录A）。花在上述稀释被中加入多粘菌案200单位/tml.--300单位/mL，可提高分离率。了、3结果判定
7.3.1观察
每隔2d~t开罐检查一次.其2次4次，观察右无溶血区及游血菌落。致病性Sh基完全溶血（强溶血），-般看不见菌落，当培养条件适宜时，在落血区可见到公雾状菌苔，无害蛇样螺旋体等呈弱吕溶血，7.3.2移植纯化
先作溶而区内物质涂片，染色镜检，如见SH样闲体，可在光菌落溶血区内移取小块琼脂划线于357
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TSA若十唯。如此每隔2天移植-次，·般2次~4次后即可纯化和保存”。7.3.3猪痫疾蛇样螺旋体噬定
7. 3. 3. 1溶血试验
将猪疾蛇样螺旋体、无害蛇样螺旋体(S.innocens)或毛肠蛇样螂旋体(S.pitasicoti)及被检菌株，分别划线于同一TSA上不同区内+经48 h培养后+规察比较其血程度。7.3.3.2肠致病性试验操作
7.3.3.2. 11 [服感染试验：试验猪2头·先饥慢 24 h~~48 h,然后每人一次胃管投分离菌株 50 m[.（含菌1亿/1nL）或直接饲眼TSA培养物每欲10血/头～20血/头，连投两次，观察0d，如有一头发病，即表示分离株为致病性Sh，若以小鼠试验，停饲24 h后，每只每饮灌服1mL（含菌3亿~5亿）,次H再灌服-一次,15 d 后削检观案盲肠病变。也可用逐无试验,先停间 36 h~72 h,每只每次灌服 5 化关体(悬丁 5 mI, ~1U mL 水中),连服 2 d,观察 15 d。上述两种试验小动物,每个菌株至少用 6 只,感染后50%出现腹泻和病变者,则为致病性 Sh。7.3.3.2.2结肠结扎试验：试验猪2头，停食48h.以外科手术的方法露出结肠撑,排空肠内容物后每隔5m～10c.间距2cm，进行双重结扎。结肠一般可结扎名段～12段，每段内可注射人一种待检菌味悬液5mI（约5亿），其中一段为生理盐水对照。另一头猪肠段作反方向注射，最后闭合腹壁。经18h~-72h扑杀试验猪，检查发各肠腔内渗出瓶增多（3mL~7mL)+内含有粘腋，纤维素或血液，粘膜肿账，充（山）血，辣片镜检有多量Sh菌体，为致病性菌袜。无害蛇样螺旋体等和对照肠段无上述变化(见图3)。
1、1.5.6.-.-致病菌株反虚（肪段积液影胀）2、3生睡盐水对。
图3猪结肠结扎试验
【将Sh断棵1d--6培养物置玻璃真至干器内，通人10头二氧化磷\)）90%氢（H)（钯为催化剂），然后下4 (. ~ 12 C 条性下保存,一般 1 个月继代一改。36X
A.1装置
附录A
（规范性附）
厌氧培装置及使用方法
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将冷钯 5 g ~20 g(钯商品名为 105 催化剂,每次使用后经 160 C:干烤 2 h~4 h,可反复使用)和接种后的TSA培养血一同放人厌氧罐内（可川玻璃干燥器代替),以凡士林薄涂髓益周边·盖严后以文具尖夹半蓝，以防漏气。然后按图A，1厌氧培养装置各部件。充
A厌氧罐：
B、C·铁爽
键冲瓶
E抽气泵.
F---负压表(其空表).
图A.1氧(H2)和二氧化碳(CO2)庆氧培养装置A.2操作
打开 A罐的活塞及B,C央，抽气至其垫度约一10°P:吋(一750 mmfg~一760 mmJIg高),将C 火紧，扭开二氧化碳(CO),)瓶旋钮,放出二氧化碳(CO),)至 A 罐,便真空度达: 0. 8× 10Pa(即一760 mmHg×80%H,=一608 mmHg),关上氧化碳(CO,)瓶旋钮。再扭开(H,)瓶旋钮,改氢(H,)使真空度达700)Pa（约--5mmHg高）,关好氢(H.)瓶。此时罐内即达二氧化碳（CO)20%，（II,)80%关闭A罐活塞、即可将A罐置37～42亡温箱中培养。362
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R.1战分：
附录B
(规范性附录）
胰陈豆陈血滋琼脂(trypticase soyblood ogar,TsA）腹酶消化蛋白陈(trypticase:）大蛋白陈（phylone）
氯化钠(NaCi)
琼脂粉
B.2校正pH7.3，加热溶解，分装于=角瓶内，灭菌（112kPa15min~-20min），冷至45（5n（。以无菌送加入牛、绵羊，马或免抗凝而或脱纤，使之含量为5%~10%。同时加入壮观毒素4()/m.或多粘菌B或E200g/ml.，或壮霉事（400ug/mL）多粘菌素及万霉素（各5)/ml.)制成选择件培养茎，以提商分离效果。
B.3若光映酶消化蛋白陈（trypticase）及大豆蛋白脉(phytone），可用胰蛋口际（trylptose）0.5.胰蛋白陈（1ryine>0.15%.水解乳蛋自（lactalhuminhydrolysate）1.5%等代替。B.4新配制的TSA应置38℃温箱121，以除去表面水分。保存于0Y～8（:冰箱内，可以布1周～2周内使用，
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