【农业行业标准(NY)】 牛流行热微量中和试验方法

ICS 11. 220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 543—2002wwW.bzxz.Net
牛流行热微量中和试验方法
Micro-neutralization test for bovine ephemeral fever2002-08-27发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T543—2002
牛流行热（简称BEF)又称牛暂时热、三日热、一日热、僵硬病等，本病在亚、非和大洋洲许多国家均有发生。该病是由弹状病毒科暂时热病毒属牛流行热病毒引起的一种急性、热性传染病，呈周期性流行。在发病期间，对牛的产奶量、使役能力、增重、精液品质都有严重影响，还可导致少数病牛瘫痪，流产甚至死亡。严重危害养牛业的发展。本标准是根据我国科研成果，与澳大利亚合作研究成果和我国的实践经验制定的。本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录,附录D为资料性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：白文彬、严隽端。346
1范围
牛流行热微量中和试验方法
本标准规定了牛流行热微量血清中和试验技术。本标准适用于牛流行热的诊断、免疫监测和流行病学调查。2 微量血清中和试验
2.1器材
2.1.1营养液和0.05%胰酶EDTA（简称ATV)液，配制方法见附录A。2.1.2细胞及其制备、传代、计数方法，见附录B。NY/T543-2002
2.1.3抗原（指示毒）、标准阳性血清、阴性血清由法定单位提供，按说明书使用。抗原毒价以及工作抗原（100TCID5u）测定方法见附录C。2.1.4微量滴定板：无菌带盖96孔微量滴定板（简称微量板）。2.1.5微量加样器：25μL、50uL及100μL单道和多道加样器，加样塑料滴头（装量为25uL～100μL，与加样器配套使用）。2.1.6二氧化碳培养箱。
2.2操作方法
2.2.1灭活
被检血清以及阴、阳性血清用前均于56'C水浴锅中灭活30min。2.2.2准备
制备工作抗原（指示毒）方法（见第C.1章），将已知毒价的合格种毒用生长液（见第A.1章）稀释成100 TCIDso/mL。
2.2.3定性试验
2.2.3.1向微量板的每孔各加25uL生长液。2.2.3.2在第一排加被检血清，每份占2孔，每孔25uL，混合均匀，即成2倍稀释。2.2.3.3用多道加样器从第1孔取25μL液体对应移人第2排孔内，混勾即成4倍稀释。再从孔内吸出25 μl丢弃。
2.2.3.4每孔加工作抗原25μl，混匀置37℃孵育60min。2.2.3.5每孔加细胞悬液100μL（30000个细胞）。细胞计数方法见第B.3章。2.2.3.6试验对照系统的设置。每批试验的对照系统的设置：标准阳性血清，从第1列至第6列，每列4孔，逐列稀释（即2倍～64倍），标准阴性血清、细胞对照和病毒对照各1列4孔。同时对本试验使用的工作抗原，随同试验再次进行测定。2.2.3.7用灭菌的盖子盖上微量板，置37C二氧化碳（CO,)培养箱内，培养5d。从第3d起逐日记录细胞病变效应(CPE)。
2.2.3.8结果判定：标准阳性血清中和抗体价≥64,标准阴性血清、病毒对照排各孔均出现CPE，工作抗原含量滴定在规定的范围之内（CPE出现的孔数与毒价查阅方法见第D.1章），细胞对照孔正常情况下，4倍稀释的被检血清列，两孔都出现CPE时，判为阴性；仅1孔出现CPE，被判为可疑，应再重复试验一一次；两孔均不产生CPE时，则被判为阳性。347
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2.2.4定量试验（测定抗体滴度）2.2.4.1向微量板的每孔各加25ul.生长液。2.2.4.2每份被检血清在微量板第1列占4孔，每孔加25ul.即待检血清为2倍稀释。2.2.4.3用多道加样器将2倍稀释的每份待检血清混勾后，吸取25μL对应移人第2排孔内，混匀即为4倍稀释，以此类推，直至稀释≥64倍，最后一列各孔内混合血清各丢弃25μl。2.2.4.4每孔各加工作抗原25μl，但细胞对照不加工作抗原，置37C下孵育60min。2.2.4.5
每孔加100μL细胞悬液（30000个细胞）。2. 2. 4. 6
盖上灭菌盖，置37C二氧化碳（CO,)箱内培养5d。从第3d起逐日记录CPE。2.2.4.7
对照系统各项试验内容、方法与定性试验相同。半数感染量的终点、中和抗体价计算和查阅方法见附录D。2.2.4.8
附录A
（规范性附录）
营养液和0.05%胰酶EDTA配制方法A.1RPMI1640营养液的配制
RPMI1640粉末
无离子水或双蒸馏水
充分溶解后经0.22μm孔径微孔滤膜滤过除菌。10.4g
1000mL
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细胞培养生长液是在滤过除菌营养液的基础上，按10%加入灭活犊牛血清，100IU/mL青霉素和100μg/ml链霉素，然后用1mol/L盐酸(HCl)溶液调整pH值至7.2左右。细胞培养维持液的犊牛血清含量为2%。A.2胰酶EDTA的配制
氯化钠
氟化钾
葡葡糖
碳酸氢钠
0. 4%胰蛋白酶
将前3种试剂加人到容器内，添加一定量的双蒸馏水搅拌全溶后，再将其余试剂缓慢加人到该溶液内搅拌全溶，最后补加双蒸馏水到1000mL，混勾，调pH值至7.6，以微孔滤膜（孔径为0.22μl.)滤过除菌。分装若干小瓶，置一20℃下保存备用。349
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B.1细胞复苏培养
附录B
（规范性附录）
细胞及其制备、传代、计数方法取出液氮内冻存的BHK21细胞安瓶1支，置37C水浴，全融后迅速开封，立即移入装10mL生长液（见第A.1章）的100mL方瓶内，放37℃下静止培养一夜，换同量生长液继续培养，经2d~3d天即可形成良好的细胞单层。
B.2细胞传代
将上述形成良好单层细胞培养瓶内生长液倒掉，以含0.05%胰酶EDTA（见第A.2章）4mL加人培养瓶中进行消化，待细胞单层疏松拉网时，用吸管贴壁反复吹打数次，制成均匀散在细胞悬液，加入0.4 mL犊牛血清混匀，以终止胰酶EDTA对细胞的作用。随后以1000 r/min的速度离心5min，细胞沉淀按1：5分钟率进行传代。
B.3细胞计数
进行微量血清中和试验时，每孔加进约30000个细胞。细胞计数的具体方法是：将发育良好的-方瓶单层细胞，按B.2方法消化离心处理后，制成4mL细胞悬液。取该液0.1mL加生长液9.9mL混勾，以毛细管吸取少量细胞悬液加人到白细胞计算板的计算室内，在显微镜下观察，并按式（B.1）、式(B. 2)、式(B. 3)计算：
n= 4大区平均细胞数=4大区细胞数4
细胞数 /mL=n× 106
为配成10mL的3×105/mL细胞悬液求出应加的细胞液数量（X）。X= 3× 10X10 = 3
n × 106
然后取细胞液XmL，加细胞生长液（见第A.2章）到10mL。350
.·(B. 3)
C.1抗原（指示毒）制备
附录C
（规范性附录）
抗原毒价及工作抗原（100TCID50）测定方法NY/T 543--2002
取生长良好的方瓶或转瓶BHK21单层细胞，倾去细胞生长液，将冻结保存的毒种用RPMI1640营养液的细胞维持液（见第A.1章）稀释100倍，按细胞生长液量的五分之一接种于单层细胞于37℃吸附1h，倾去病毒液，添加与细胞生长液量相同的细胞维持液。置37C培养，每日观察1次2次，当细胞病变达75%以上时收获，反复冻融3次后，放一40℃冰箱冻结保存备用。C.2抗原毒价（TCID50）测定
用RPMI1640生长液将上述制备的抗原作10倍系列稀释，取10-4、10~5、10-6、10-7四个滴度分别接种于每孔含100μLBHK2i细胞液的96孔塑料板的4个孔内，每孔25μL。同时设不接毒的细胞孔对照。放37C二氧化碳（CO2）培养箱，培养5d，观察CPE出现孔数，计算毒价（见第D.1章）和TCIDso，新鲜的抗原毒价应≥106°TCIDso。C.3工作抗原毒价（100TCID50）的测定和计算方法测定和计算的具体步骤如下：首先将待检抗原（病毒液）作10倍、50倍稀释，前者称A液，后者称B液，同时对A、B液进行毒价（用以10的对数表示）测定。例如A液的毒价是3.5，B液的毒价是2.75，那么则取（3.5～2.75）一4=0.19作为等差常数，然后用A液的毒价值顺次减去常数，当所得的差等于或接近2时的病毒稀释度即为工作抗原用量（100TCID5）（见表C.1）。表 C. 1 TCID5a计算示例
A液病毒稀释度
A液毒价值减去
系数值的差
1：50
1:901：100
3.50.19|3. 310. 19|3. 120.192. 930. 192. 74-0. 192. 550.192.366-0.192.17-0.191.98--0.19
由对应表可见，差值1.98接近2，故把待检抗原（病毒液）稀释80倍，即为微量血清中和试验所用的100TCID5工作抗原。
C.4标准阳性血清
系用牛流行热病毒强毒人工感染1岁的小公奶牛或自然感染牛耐过后3周～4周，采集分离的血清经中和抗体效价测定其效价应≥128倍。C.5标准阴性血清
系采自非污染区健康牛分离的血清，经血清中和试验检查，应无牛流行热特异抗体。351
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附录D
（资料性附录）
毒价计算法
D.1细胞病变（CPE)出现孔数与查阅毒价法见表D.1。
病毒稀释
出现孔数
1. 0+ 1. 6
改进的Reed-Meunch法毒价查阅表病毒稀释
出现孔数
病毒稀释
出现孔数
注：本表的终末毒价以TCIDso=10+b/mL表示。其中以微量板测定的毒价10°/25μL表示，由于1mL（1000μL）比25μl.大40倍，所以改成终末毒价时，需在前者基础上，加1og40=1.6即为终末毒价，用a+b之和表示。
测定毒价的各滴度列，每增加一个CPE孔，毒价就提高0.25，个别情况下，相邻的病毒浓度大的测毒列,CPE孔未现，而病毒浓度低的测毒列，反而出现1个或2个CPE孔，此时应将后者向病毒浓度大的测毒列移动。
关于确定终末毒价的举例：如稀释度为10-2的待检病毒列4孔均出现CPE，其毒价则为2.5+1.6=4.1，以此类推，被测病毒稀释到10°7时，有3孔出现CPE，其毒价则为7.25+1.6=8.85。D.2中和抗体效价计算和查阅方法见表D.2。
血清稀释倍数
改进的Reed-Meunch法中和抗体价查阅表微量板孔号及CPE出现情况
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注：中和抗体效价位于纵向血清稀释倍数与横向CPE出现孔数的交叉点上。如血清稀释4时，该排4孔中1孔出现CPE，中和抗体价为5；2孔出现CPE，中和抗体为4;3、4孔出现CPE时，中和抗体价均为3，又如血清稀释64倍时，该排4孔中1孔出现CPE，中和抗体价为77；2孔出现CPE，中和抗体价为64：3孔出现CPE，中和抗体价为51；4孔全出现CPE，中和抗体价为45，其他情况类推。353
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