【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂

ICS 07.100.30
中华人民共和国国家标雅
GB/T4789.28—2003
代替GB/T4789.28—1994
食品卫生微生物学检验
染色法、培养基和试剂
Microbiological examination of food hygiene-Stainning methods,culture mediums and reagents2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
CB/T4789.28—2003
本标推对GB/T4789.28-1994食品卫生微生物学检验本标准与GB/T4789.28—1994相比主要修改如下：按照GB/T1.1一2000对标准文本的格式进行修改。删去4.78中的高盐察氏培养基。本标准自实施之日起，GB/T4789.28-1994同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。染色法、培养基和试剂》进行修订。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人，周桂莲、刘宏道、罗雪云、李风琴、付萍。本标准于1984年首次发布，1994年第一次修订，本次为第二次修订。192
1范围
食品卫生微生物学检验
染色法、培养基和试剂
本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于食品和食物中毒样品中各类微生物的检验。2染色液配制及染色法
2.1美蓝染色法
2.1.1吕氏碱性美蓝染色液
95%乙醇
0.01%氢氧化钾溶液
将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。2.1.2染色法
将涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液，染1min～3tnin，水洗，待干，镜检。2.1.3结果
菌体呈蓝色。
2.2革兰氏染色法
2.2.1结晶紫染色液
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。2.2.2革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
GB/T4789.28—2003
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。2.2.3沙黄复染液
95%乙醇
蒸馏水
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。2.2.4染色法
2.2.4.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。2.2.4.2
滴加95%乙醇脱色，约305；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱2.2.4.3
色10s。
GB/T4789.28--2003
2.2.4.4水洗，滴加复染液，复染1min。水洗，待干，镜检。2.2.5结果
革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注：亦可用1110稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。2.3耐酸性染色法（蔓-倪二氏法）2.3.1石炭酸品红染色液
碱性品红
95%乙醇
5%酚水溶液
将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。2.3.23%盐酸-乙醇
浓盐酸
95%乙醇
2.3.3复染液
吕氏碱性美蓝染色液。
2.3.4染色法
2.3.4.1将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。染液如因蒸发减少时，应随时添加。染5min，倾去染液，水洗。2.3.4.2滴加盐酸-乙醇脱色，直至无红色脱落为止（所需时间视涂片厚薄而定，一般为1min～3min），水洗。
2.3.4.3滴加吕氏碱性美蓝染色液。复染30s～1min，水洗，待干，镜检。2.3.5结果：耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质量蓝色。2.4柯氏染色法
2.4.1染色液
2.4.1.10.5%沙黄液。
2.4.1.20.5%孔雀绿液。
2.4.2染色法
2.4.2.1将涂片在火焰上固定，滴加0.5%沙黄液，并加热至出现气泡，约2min~3min，水洗。2.4.2.2滴加0.5%孔雀绿液，复染40s~50s。水洗，待干，镜检。2.4.3结果
布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色。2.5奥尔特氏英膜染色法
2.5.1染色液
蒸馏水
用乳钵研磨溶解。
2.5.2染色法
将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸气后，继续染3min。水洗，待干，镜检。2.5.3结果
炭疽芽胞杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。2.6瑞氏染色法
2.6.1染色液
瑞氏色素
用乳钵研磨溶解。
2.6.2染色法
2.6.2.1涂片待自然干燥后，滴加染色液，固定1min。2.6.2.2加人等量蒸馏水（pH6.5)，染色3min~5min。2.6.2.3用蒸馏水冲洗，待干，镜检。2.7鞭毛染色法
GB/T4789.28-2003
2.7.1染色液的配制
2.7.1.1甲液：称单宁酸5g氰化高铁（FeCl)1.5g，溶于100mL蒸馏水中，待溶解后加人1%的氢氧化钠溶液1mL和15%的甲醛溶液2mL。2.7.1.2乙液：称2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止（此为关键性操作，应特别小心）。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，2d～3d基本无效。
2.7.2染色法
在风于的载玻片上滴加甲液，4min～6min后，用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约半分钟（加热时注意勿使出现干燥面）。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检，菌体及鞭毛为深褐色到黑色。2.8碱性复红染色法
将0.5g碱性复红染料溶解于20mL95%乙醇中，然后用蒸增水稀释至100mL。如有不溶物时，可用滤纸过滤，或静置后取上清液备用。注：本染色液系用于苏云金芽胞内蛋白质毒素结晶的染色，藉以与蜡样芽胞杆菌相区别。3生化试验培养基和试剂
3.1Hugh-Leifson培养基（O/F试验用）3.1.1成分
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
0.2%溴摩香草酚蓝溶液
蒸馏水
1000ml
3.1.2制法
将蛋白陈和盐类加水溶解后，校正pH至7.2。加人葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指示剂。混匀后，分装试管，121℃高压灭菌15min，直立凝固备用。3.1.3-试验方法
从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两支培养基，其中一支于接种后滴加溶化的1%琼脂液于表面，高度约1cm，于36℃士1℃培养。3.1.4结果
结果见表1。
GB/T 4789.28—2003
反应类型
发酵型(F)
氧化型(O)
产碱型(A)
3.2糖发酵管
3.2.1成分
牛肉膏
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠（NazHPO·12H,O）
0.2%溴麝香草酚蓝溶液
蒸馏水
3.2.2制法
封口的培养基
1000mL
开口的培养基
3.2.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加人葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。
3.2.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加人于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
注：煎糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。3.2.3试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36℃士1℃培养，一般观察2d～3d。返缓反应需观察14d~30d。
3.3ONPG培养基
3.3.1成分
邻硝基酚β-D-半乳糖苷（ONPG）(O-Nitrophenyl-p-D-galactopyranoside)0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）1%蛋白陈水（pH7.5)
3.3.2制法
将ONPG溶于缓冲液内，加人蛋白陈水，以过滤法除菌，分装于10tmm×75mm试管，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧。
3.3.3试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物一满环接种于36℃士1℃培养1h～3h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生，则于1h～3h变黄色，如无此酶则24h不变色。3.4缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用）3.4.1成分
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
1000mL
3.4.2制法
溶化后校正pH，分装试管，每管1mL，121℃高压灭菌15min。3.4.3甲基红MR)试验
GB/T4789.28—2003
自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于36℃士1℃培养2d～5d，哈夫尼亚菌则应在22℃～25℃培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加人20mL蒸馏水。3.4.4V-P试验
用琼脂培养物接种本培养基中，于36℃士1℃培养2d～4d。哈夫尼亚菌则应在22℃～25℃培养，加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36℃土1℃培养4h再进行观察。3.5西蒙氏柠檬酸盐培养基
3.5.1成分
氮化钠
硫酸镁（MgSO,·7H,O）
磷酸二氢铵
磷酸氢二钾
柠檬酸钠
蒸馏水
0.2%溴麝香草酚蓝溶液
3.5.2制法
1000mL
先将盐类溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌15min。放成斜面。3.5.3试验方法
挑取少量琼脂培养物接种，于36℃士1℃培养4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。
3.6克氏柠檬酸盐培养基
3.6.1成分
柠檬酸钠
葡萄糖
酵母没膏
单盐酸半胱氨酸
磷酸二氢钾
0.2%酚红溶液
蒸馏水
3.6.2制法
1000ml
加热溶解，分装试管，121℃高压灭菌15min，放成斜面。3.6.3试验方法
用琼脂培养物接种整个斜面，在36℃土1℃培养7d，每天观察结果。阳性者培养基变为红色。197
GB/T4789.28—2003
3.7丙二酸钠培养基
3.7.1成分
酵母浸膏
硫酸铵
磷酸氢二钾
磷酸二氢钾
氯化钠
丙二酸钠
0.2%溴麝香草酚蓝溶液
蒸馏水
3.7.2制法
1000mL
先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加人指示剂，分装试管，121℃高压灭菌15min。3.7.3试验方法
用新鲜的琼脂培养物接种，于36℃士1℃培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。3.8葡葡糖铵培养基
3.8.1成分
氯化钠
硫酸镁（MgSO.：7H.O)
磷酸二氢铵
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏馅水
0.2%溴香草酚蓝溶液
3.8.2制法
1000mL
先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌15min，放成斜面。3.8.3试验方法
用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环内含菌数在20～100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于36℃士1℃培养24h。阳性者葡葡糖铵斜面上有正常大小的菌落生长：阴性者不生长，但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。马尿酸钠培养基
3.9.1成分
马尿酸钠
肉浸液
3.9.2制法
将马尿酸钠溶解于肉浸液内，分装于小试管内，并于管壁画一横线。以标志管内液面高度，高压灭茵121℃20min。
3.9.3试剂
三氮化铁（FeCla·6H2O)12g，溶于2%盐酸溶液100mL中即成。3.9.4试验方法
GB/T4789.28-—2003
用纯培养物接种，于42℃培养48h，观察培养液是否到达试管壁上记号处，如不足时，用蒸馏水补足至原量。经离心沉淀，吸取上清液0.8mL，加人三氯化铁试剂0.2mL，立即混合均匀，经10min~15min，观察结果。
3.9.5结果
出现恒久沉淀物为阳性。
3.10营养明胶
3.10.1成分
蛋白陈
牛肉膏bzxz.net
蒸馏水
pH6.8~7.0
3.10.2制法
1000mL
加热溶解、校正至pH7.4~7.6，分装小管，121℃高压灭菌10min，取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.8~7.0。
3.10.3试验方法
用琼脂培养物穿刺接种，放在22℃～25℃培养，每天观察结果，记录液化时间。或放在36℃士1℃培养，每天取出，放冰箱内30min后再观察结果。3.11苯丙氨酸培养基
3.11.1成分
酵母浸膏
DI-苯丙氨酸（或L-苯丙氨酸1g）磷酸氢二钠
氯化钠
蒸馏水
3.11.2制法
1000mL
加热溶解后分装试管，121℃高压灭菌15min，使成斜面。3.11.3试验方法
自琼脂斜面上挑取大量培养物，移种于苯丙氨酸琼脂，在36℃土1℃培养4h或18h~24h。滴加10%三氯化铁溶液2滴～3滴，自斜面培养物上流下，苯丙氨酸脱氮酶阳性者呈深绿色。3.12氨基酸脱羧酶试验培养基
3.12.1成分
蛋白陈
醇酵母浸膏
葡萄糖
蒸馏水
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液
L-氨基酸或 DL-氨基酸
1000mL
0.5或1g/100mL
GB/T4789.28—2003
3.12.2制法
除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。1-氨基酸按0.5%加人，DL-氨基酸按1%加人。再行校正pH至6.8。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。3.12.3试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36℃土1℃培养18h～24h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。3.13蛋白陈水（靛基质试验用）3.13.1成分
蛋白陈(或胰蛋白陈)
氯化钠
蒸馏水
3.13.2制法
1000ml
按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。3.13.3靛基质试剂
3.13.3.1柯凡克试剂：将5g对二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加人浓盐酸25mL。3.13.3.2欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL.95%乙醇内，然后缓慢加人浓盐酸20mL。3.13.4试验方法
挑取小量培养物接种，在36℃士1℃培养1d~～2d，必要时可培养4d～5d。加人柯凡克试剂约0.5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加人欧-波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白陈买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。3.14硫酸亚铁琼脂（硫化氢试验用）3.14.1成分
牛肉膏
酵母浸膏
蛋白陈
硫酸亚铁
硫代硫酸钠
氮化钠
蒸馏水
3.14.2制法
1000mL
加热溶解，校正pH，分装试管，115℃高压灭菌15min，取出直立侯其凝固。3.14.3试验方法
挑取琼脂培养物，沿管壁穿刺，于36℃士1℃培养1d～2d，观察结果。产硫化氢者使培养基变为黑色。
注：肠杆菌科细菌测定硫化氢的产生，应采用三糖铁琼脂或本培养基。3.15尿素琼脂
3.15.1成分
蛋白陈
葡萄糖
磷酸二氢钾
0.4%酚红溶液
蒸馏水
20%尿素溶液
pH7.2±0.1
3.15.2制法
1000mL
GB/T4789.28—2003
将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正pH，加人琼脂，加热溶化并分装烧瓶。121℃高压灭菌15min。冷至50℃～55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终pH应为7.2士0.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。3.15.3试验方法
挑取琼脂培养物接种，在36℃土1℃培养24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
3.16化钾（KCN)培养基：
3.16.1成分
蛋白陈
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
蒸馏水
0.5%氰化钾溶液
3.16.2制法
1000mL
将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL（最后浓度为1：10000)，分装于12mm×100mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放在4℃冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氢化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。3.16.3试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白陈水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾（KCN)培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36℃士1℃培养1d～2d，观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2d细菌不生长为阴性（抑制）。注；氰化钾是剧毒药物，使用时应小心，切勿活染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，产生氢鼠酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。3.17硝酸盐培养基
3.17.1成分
硝酸钾
蛋白陈
蒸馏水
3.17.2制法
1000mL
溶解，校正pH，分装试管，每管约5mL，121℃高压灭菌15min。201
GB/T4789.28-—2003
3.17.3硝酸盐还原试剂
3.17.3.1甲液：将对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。3.17.3.2乙液：将甲胺0.5g溶解于2.5mol/L：乙酸溶液100mL中。3.17.4试验方法
接种后在36℃士1℃培养1d～4d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时于立刻或数分钟内显红色。
注：本试验阴性的原因有三：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加人锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。3.18氧化酶试验
3.18.1试剂
3.18.1.11%盐酸二甲基对苯二胺溶液：少量新鲜配制，于冰箱内避光保存。3.18.1.21%α-萘酚-乙醇溶液。3.18.2试验方法
3.18.2.1取白色洁净滤纸沾取菌落。加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深；再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色。阴性于两分钟内不变色。3.18.2.2以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。3.19细胞色素氧化酶试验
3.19.1试剂
3.19.1.11%盐酸二甲基对苯二胺溶液。3.19.1.21%α-茶酚-乙醇溶液。3.19.2试验方法
取37℃（或低于37℃)培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各2滴～3滴，从斜面上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂混合液滴在菌落上。
3.19.3结果
于2min内呈现蓝色者为阳性。阳性培养物大多数于半分钟内出现强阳性反应，2min以后出现微弱或可疑反应均作为阴性结果。3.20过氧化氢酶试验
3.20.1试剂
3%过氧化氢溶液：临用时配制。3.20.2试验方法
挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。3.20,3结果
于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。3.21过氧化物酶试验
3.21.1试剂
3.21.1.12%儿茶酚溶液。
3.21.1.23%过氧化氢溶液。
3.21.2试验方法
挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加2%儿茶酚溶液1mL及3%过氧化氢溶液1mL。静置于室温（20℃）中30min~60rnin，观察结果。3.21.3结果
阳性反应，细菌变为黑褐色，阴性反应，细菌不变色。202
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。