标准简介/下载中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 2462—2010
棉花曲叶病毒检疫鉴定方法
Identification of cotton leaf curl Begomovirus
2010-01-10 发布 2010-07-16 实施
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
发 布
前 言
本标准的附录 A 为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、浙江大学、中国检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人：张祥林、周雪平、朱水芳、王翀、吴卫、余永杰。
本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。
棉花曲叶病毒检疫鉴定方法
1 范围
本标准规定了棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Begomovirus，简称 CLCuV)的检疫鉴定方法。
本标准适用于可能带有棉花曲叶病毒的活体寄主植物的检疫鉴定。
2 原理
棉花曲叶病毒的分类地位属于双生病毒科(Geminiviridae)、菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)。该病毒的生物学特性、血清学特性和分子生物学特征是制定本标准的主要依据(参见附录A)。
3 仪器设备用具
3.1 仪器设备
电子天平(感量 $1/1000 \text{ g}$)、超净工作台、高速冷冻离心机、小型低速离心机、pH计、恒温水浴锅、微量榨汁机、超低冰箱、高压灭菌器、酶标仪、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪等。
3.2 用具
研钵、培养皿、可调式微量移液器($2 \text{ }\mu\text{L}$、$10 \text{ }\mu\text{L}$、$20 \text{ }\mu\text{L}$、$100 \text{ }\mu\text{L}$、$200 \text{ }\mu\text{L}$、$1000 \text{ }\mu\text{L}$)及相应的移液器头、96孔酶联反应板、离心管($1.5 \text{ mL}$、$10 \text{ mL}$)、PCR管($0.2 \text{ mL}$)、量筒、烧杯、镊子。
4 试剂、缓冲液及溶液
4.1 $10\times$PBST缓冲液
氯化钾(KCl) 2 g，氯化钠(NaCl) 80 g，磷酸二氢钾($\text{KH}_2\text{PO}_4$) 2 g，磷酸氢二钠($\text{Na}_2\text{HPO}_4 \cdot 12\text{H}_2\text{O}$) 11.5 g、吐温20(Tween-20) 5 mL，用浓盐酸(HCl)调节pH至7.4，加蒸馏水定容至 $1000 \text{ mL}$，$4^\circ\text{C}$条件下贮存。
4.2 样品提取缓冲液
亚硫酸钠($\text{Na}_2\text{SO}_3$) 1.3 g、聚乙烯基吡咯烷酮(MW $24000 \sim 40000$, PVP) 20 g，叠氮钠($\text{NaN}_3$) 0.2 g，吐温20(Tween-20) 20 mL溶解于 $800 \text{ mL}$ $1\times$PBST中，用盐酸调节pH至7.4，加 $1\times$PBST定容至 $1000 \text{ mL}$, $4^\circ\text{C}$条件下贮存。
4.3 包被缓冲液
碳酸钠($\text{Na}_2\text{CO}_3$) 1.59 g，碳酸氢钠($\text{NaHCO}_3$) 2.93 g、叠氮钠($\text{NaN}_3$) 0.2 g，用浓盐酸(HCl)调节pH至9.6，加蒸馏水定容至 $1000 \text{ mL}$, $4^\circ\text{C}$条件下贮存。
4.4 洗涤缓冲液
将 $1\times$PBST缓冲液用浓盐酸(HCl)调节pH至7.4，$4^\circ\text{C}$条件下贮存。
4.5 酶标抗体缓冲液
$1\times$PBST缓冲液 $800 \text{ mL}$、小牛血清白蛋白(BSA) 2 g、聚乙烯基吡咯烷酮 20 g，叠氮钠($\text{NaN}_3$) 0.2 g，用无菌蒸馏水定容至 $1000 \text{ mL}$, $4^\circ\text{C}$条件下贮存。
4.6 底物(PNPP)缓冲液
二乙醇胺 $97 \text{ mL}$、叠氮钠($\text{NaN}_3$) 0.2 g，用浓盐酸(HCl)调节pH至9.8，用无菌蒸馏水定容至 $1000 \text{ mL}$, $4^\circ\text{C}$条件下贮存。
4.7 底物(PNPP)溶液
将4-硝基苯磷酸盐(PNPP) 100 mg溶解于PNPP底物缓冲液 $100 \text{ mL}$中，现配现用。
