【国家标准】 食品安全国家标准 食品中泛酸的测定

2023新版
中华人民共和国国家标准
GB5009.210—2023
食品安全国家标准
食品中泛酸的测定
2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2024-03-06实施
2023新版
本标准代替GB5009.210—2016食品安全国家标准食品中泛酸的测定》。
本标准与GB5009.210—2016相比，主要变化如下：增加了液相色谱-串联质谱法；
修改了微生物法试样的前处理方法，并增加了微孔板测定方法。GB5009.210—2023
1范围
2023新版
食品安全国家标准
食品中泛酸的测定
本标准规定了食品中泛酸的测定方法GB5009.210—2023
本标准第一法适用于婴幼儿配方食品（除特殊医学用途婴儿配方食品外）、婴幼儿辅助食品、乳制品、饮料、营养补充剂中泛酸的测定。本标准第二法和第三法适用手食品中泛酸的测定。第一法
液相色谱法
2原理
试样用热水提取后，经C1B反相色谱柱分离，以保留时间定性，外标法定量。试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1
盐酸(HCI)。
磷酸（HPO)。
磷酸二氢钾（KH.PO）。
七水合硫酸锌（ZnSO·7H,O)。
乙腈（CH.CN）：色谱纯
α-淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。试剂配制
盐酸（0.1mol/L）：吸取8.3mL盐酸至800mL水中，加水稀释至1000mL.混勾。盐酸（1.0mol/L）：吸取8.3mL盐酸至80mL水中，加水稀释至100mL，混匀。硫酸锌溶液（0.5mol/L）：称取14.4g七水合硫酸锌，加水溶解并稀释至100mL3.2.3
3.2.4磷酸二氢钾溶液（0.02mol/L）：称取2.722g磷酸二氢钾，加500mL水溶解，用磷酸调节pH至3.0土0.1，用水稀释至1000mL，用0.45μm滤膜过滤。3.3
标准品
D-泛酸钙标准品（C1aHaCaN.O1o，CAS号：137-08-6）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
GB5009.210—2023
3.4标准溶液配制
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3.4.1、泛酸标准储备液（500ug/mL）：准确称取136mgD-泛酸钙标准品（精确至0.1mg）.加水溶解并转入到250mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀。标准储备液一18℃及以下避光保存，可保存3个月。3.4.2泛酸标准中间溶液（100μg/mL）：准确吸取标准储备溶液20.0mL于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。临用现配
3.4.3泛酸标准工作溶液：分别准确吸取泛酸标准中间液1.0mL、2.0mL.4.0mL8.0mL、16.0mL和32.0mL于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，得到浓度分别为1.0ug/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、16.0μg/mL和32.0μg/mL的泛酸标准工作溶液。临用现配。4仪器和设备
4.1天平：感量0.1mg。
恒温振荡水浴箱：振荡频率100r/min士20r/min超声波振荡器。
pH计：精度为士0.01。
离心机：转速≥8000r/min。
0.45μm滤膜。
高效液相色谱仪：带紫外检测器或二极管阵列检测器。5分析步骤
5.1试样制备
固态试样粉碎并混合均勾。碳酸饮料需超声波去除二氧化碳，其他液态试样摇匀。5.2试样提取
5.2.1饮料、营养素补充剂
准确称取或量取适量试样，精确至0.001g，一般固体试样0.2g~2g，液态试样10g~20g，置于50mL锥形瓶中加入约30mL40℃～50℃温水超声提取20min。转人50mL容量瓶中，用水稀释至刻度并充分混匀后，转人离心管，8000r/min离心2min，取上清液过0.45μm滤膜，滤液待上机测定。
5.2.2婴幼儿配方食品（除特殊医学用途婴儿配方食品外）、婴幼儿辅助食品、乳制品准确称取适量试样，精确至0.001g+一般固态试样约5g.液态试样约20g。置于100mL锥形瓶中，加入约30mL40℃～50℃温水。不含淀粉试样，直接超声提取20min。含淀粉试样，加入α-淀粉酶0.2g，振摇混匀，盖上瓶塞，在55℃土5℃水浴条件下振摇酶解30min，取出试样液，冷却至室温。用0.1mol/L盐酸或1.0mol/L盐酸调节pH至5.0土0.1，加人5mL0.5mol/L硫酸锌溶液，充分混合。转人50mL容量瓶中，用水稀释至刻度并充分混匀后，转人离心管，8000r/min离心2min，取上清液过0.45μm滤膜，滤液待上机测定。5.3液相参考色谱条件
液相参考色谱条件如下：
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色谱柱：ODS-Cls（粒径5μm，250mmX4.6mm）或具有同等性能的色谱柱。柱温：35℃±0.5℃。
检测波长：200nm。
流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈（95+5）。流速：1.0mL/min。
进样量：10或20μL
5.4测定
标准曲线测定
将泛酸标准工作液依次进行色谱分析（标准色谱图见附录A中图A.1）。以标准工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。5.4.2试样溶液的测定
将试样测定液进行色谱分析，根据试样峰面积从标准曲线中查得相应的泛酸浓度。6
分析结果的表述
试样中泛酸的含量按式(1)计算。式中：
X=exVXf
试样中泛酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；从标准曲线得到的试样溶液中泛酸的质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）；试样测定液总体积，单位为毫升（mL)；试样测定液稀释倍数；
试样的取样量，单位为克（g)；换算系数。
计算结果保留3位有效数字。
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%8其他
：（1)
8.1对于固体试样，当称样量为5g定容至50ml时，检出限为0.025mg/100g.定量限为0.08mg/100g。8.2对于液体试样，当取样量为20g，定容至50mL时，检出限为0.0063mg/100g，定量限为0.02mg/100g。GB5009.210—2023
9原理
第二法
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液相色谱-事联质谱法wwW.bzxz.Net
试样经酶解、提取、离心、过滤后，经C1反相色谱柱分离，采用串联质谱多离子反应监测方式检测，稳定同位素稀释内标法定量。
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
乙睛（CH.CN）：色谱纯。
甲酸（HCOOH）：色谱纯。
盐酸（HCI）。
冰乙酸（CHO2）。
乙酸锌［Zn(CH,COO)，]。
亚铁氰化钾[K,Fe(CN)。]。
三羟甲基氨基甲烷(C,HNO,）)。碳酸氢钠（NaHCO，）。
碳酸氢钾（KHCO,）。
甲苯（C,H）。
α-淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。阴离子交换树脂：Dowex1×8粒度38μm75μm。碱性磷酸酶：来源于牛肠粘膜，EC3.1.3.1，酶活力≥10U/mg。鸽子肝脏丙酮提取物干粉：酶活力≥0.1U/g。试剂配制
甲酸溶液（0.1%）：吸取1mL甲酸，用水稀释至1000mL，混匀。乙酸锌溶液（300g/L）：称取30.0g乙酸锌，用水溶解并稀释至100mL亚铁氰化钾溶液（150g/L）：称取15.0g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至100mL。Tris缓冲液：称取121.0g三羟甲基氨基甲烷溶于500mL水中，用冰乙酸调pH至8.1士0.2.加水稀释至1000mL,混匀，贮存于2℃~8℃冰箱中。10.2.5
碳酸氢钠溶液（0.1mol/L）：称取0.84g碳酸氢钠，加水溶解并稀释至100mL，混匀。碱性磷酸酶溶液：称取0.2g碱性磷酸酶至研钵中，少量多次加水研磨至溶解，用水稀释至10mL。临用现配，存于2℃~8℃冰箱预冷。10.2.7
盐酸溶液（1mol/L）：吸取83mL盐酸到800mL水中，加水稀释至1000mL，混匀。碳酸氢钾溶液（0.02mol/L）：称取2g碳酸氢钾，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。树脂活化：称取100g阴离子交换树脂于2L锥形瓶中，加入1L1mol/L盐酸溶液，置于振荡器上充分振摇10min，用铺有滤纸的布氏漏斗过滤。将阴离子交换树脂转回锥形瓶，再加入1L1mol/L盐酸溶液重复振摇10min、过滤。向阴离子交换树脂加入1L水振摇洗涤10min，过滤，重复用水洗涤2023新版
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10次，转移至锥形瓶中。向阴离子交换树脂加入少量水，混匀，逐滴向阴离子交换树脂加人Tris缓冲液，调节pH至8.0士0.1。置于2℃～8℃冰箱保存.2d内使用10.2.10鸽子肝脏提取液：配制此试剂前一天将所用容器放入2℃～8℃冰箱中冷藏过夜。称取30g鸽子肝脏丙酮提取物干粉.放人预冷的研钵中，冰浴条件下分次加人0.02mol/L碳酸氢钾溶液300mL，研磨成匀质混悬液。将混悬液转至预冷的具盖离心管中，盖紧后充分振摇后，放人一20℃冰箱内静置10min。取出后，3000r/min离心5min，将上清液转至500ml预冷的广口瓶中。向上清液中加人部分活化树脂（约150g），放入冰水浴中振摇5min。倒人预冷离心管中3000r/min离心5min。将上清液移入另一500mL预冷的广口瓶中，一20℃静置10min。再加人剩余活化树脂（约150g），放入冰浴中振播5min，倒人离心管中，3000r/min离心5min。收集上清液，一20℃静置10min，分装于预冷的具塞试管中，一20℃冷冻保存，可保存1年。用前预置于2℃～8℃冰箱内化冻并使用。10.3标准品
10.3.1D-泛酸钙标准品（CHazCaN，Oo.CAS号：137-08-6）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
10.3.213C：1N2-泛酸钙（3CCi2H2CalN2O1oCAS号：356786-94-2)：纯度≥97%。10.4标准溶液配制
10.4.1泛酸标准储备液（500μg/mL）：准确称取136mgD泛酸钙标准品（精确至0.1mg）.加水溶解并转入到250mL容量瓶中，稀释至刻度，混匀。标准储备液一18C及以下避光保存，可保存3个月10.4.2泛酸标准中间溶液（10μg/mL）：准确吸取标准储备液1mL于50mL容量瓶中，加水稀释至刻度。临用现配。
10.4.3内标储备液（50μg/mL）：称取5mg13C，1N-泛酸钙，加水溶解并转入到100mL容量瓶中，稀释至刻度。内标储备液一18℃及以下避光保存，可保存6个月。10.4.4泛酸标准系列工作液：吸取适量标准中间溶液于25mL容量瓶中，加人100L内标储备液，用水稀释至25mL得到泛酸标准工作液浓度分别为10ng/mL、50ng/mL100ng/mL、300ng/mL、600ng/mL、1000ng/mL和1500ng/mL。临用现配。11
仪器和设备
液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。11.2
分析天平：感量分别为0.1mg和0.01g。11.3
pH计：精度为士0.01。
离心机：转速≥8000r/min。
超声波振荡器。
压力蒸汽消毒器：121℃。
恒温振荡水浴箱：振荡频率100r/min士20r/min。涡旋混合器。
分析步骤
12.1样品前处理
12.1.1谷薯类、肉蛋类、蔬果类、菌藻类、豆及坚果类等食品5
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准确称取适量试样（含0.02mg0.2mg泛酸，精确到0.01g），转人至100ml锥形瓶中。加人10mLTris缓冲液，30mL水，振荡混勾。于121℃高压条件下水解20min。冷却至室温，依次加入0.1mL碳酸氢钠溶液、0.4mL碱性磷酸酶溶液，0.2mL鸽子肝脏提取液，混匀后，加100μL甲苯，具塞。37℃士1℃下以100r/min士20r/min振幅恒温振荡8h~10h。转移至100mL容量瓶中，加水至刻度，过滤。
移取10.0mL上述液体于50mL离心管中，加人100μL内标储备液，加水至20mL，涡旋10s。分别加人0.4mL乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，加水至25mL，涡旋10s。静置10min~30min后，8000r/min离心2min。上清液过0.22μm尼龙滤膜后进样分析。12.1.2
婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、特殊医学用途配方食品、乳制品、饮料、营养素补充剂、果冻准确称取5g固体试样（精确到0.01g）.加水至50g（精确到0.01g）。加人a-淀粉酶0.2g，振摇混匀，盖上瓶塞，在55℃士5℃水浴条件下振摇酶解30min。称取0.5g~5.0g上述液体（精确到0.1mg），置于50mL离心管中。液体试样混匀后直接称取0.5g~5.0g（精确到0.1mg），置于50ml离心管中。
加人100uL内标储备液，加水至20mL，涡旋10s。分别加人0.4mL乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液，加水至25mL，涡旋10s。静置10min~30min后，8000r/min离心2min。上清液过0.22um尼龙滤膜后进样分析。
仪器参考条件
液相参考色谱条件
液相参考色谱条件如下：
色谱柱：Cs，1.8μm，100mmX2.1mm，或相当者。柱温：35℃。
流速：0.3mL/min。
进样量：2uL。
流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为乙腈。液相色谱梯度洗脱条件见表1。表1液相色谱梯度洗脱条件
质谱参考条件
质谱参考条件如下：
电离方式：ESI十。
0.1%甲酸溶液
毛细管电压：3.0kV。
干燥气温度：400℃。
干燥气流速：800L/h。
锥孔反吹气流速：150L/h。
碰撞气为高纯氩。
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六通阀：0min～2min流动相进废液，2min～7min流动相进质谱。监测方式：MRM，多反应监测
监测离子对、碰撞能量参考条件见表2。表2质谱参数
化合物
BC。，N-泛酸钙
标准曲线的制作
定性离子对
220/90
220/124
224/94
定量离子对
220/90
224/94
锥孔电压
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磁撞能量
将标准系列工作液分别注人液相色谱-串联质谱仪中，测定相应的泛酸与13C6：1N-泛酸钙的峰面积，以标准系列工作液中泛酸的浓度为横坐标，以泛酸的响应值与3C，15N-泛酸钙的响应值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。泛酸标准溶液的色谱图参见附录A中图A.2。12.4试样溶液的测定
将试样溶液注人液相色谱-串联质谱仪中，得到泛酸的响应值与C，N2-泛酸钙的响应值的比值，根据标准曲线得到待测液中泛酸的浓度。12.5定性测定
在相同试验条件下进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准品的保留时间相比较，变化范围应在士2.5%之内，并且在样品质谱图中所选择的离子均出现，而且所选择的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相对偏差不超过表3规定的范围。表3定性离子相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度
允许的相对偏差
13分析结果的表述
试样中泛酸的含量按式(2)计算。20%~50%
10%~20%
《10%
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式中：
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试样中泛酸的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；由标准曲线得到的试样溶液中泛酸的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；试样测定液体积，单位为毫升（mL）；一试样的取样量，单位为克（g）；换算系数：
稀释因子。
计算结果保留3位有效数字。
14精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。15其他
15.1对于固态试样，当取样量为5g，定容至25mL时，本方法检出限为0.025mg/100g，定量限为0.05mg/100g
15.2对于液体试样，当取样量为5g，定容至25mL时，本方法检出限为0.0025mg/100g，定量限为0.005mg/100g。
微生物法
第三法
16原理
泛酸是植物乳植杆菌（Lactiplantibacillusplantarum）生长所必需的营养素，在一定可控的条件下培养一段时间后，植物乳植杆菌的生长与泛酸含量呈现一定线性关系。因植物乳植杆菌生长导致的培养液浑浊度的变化可采用分光光度计或酶标仪进行透光率（或吸光度值）测定，根据培养液中泛酸含量与透光率（或吸光度值）拟合曲线方程计算出试样中泛酸的含量17
试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。17.1试剂
盐酸（HCI)。
冰乙酸（CH,O2）。
氢氧化钠（NaOH)。
氯化钠（NaCI）。
碳酸氢钠（NaHCO）。
碳酸氢钾（KHCO）。
三水合乙酸钠（CHO,Na·3H.O)。三羟甲基氨基甲烷（C,HNO,)。
9甲苯(C,H）。
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阴离子交换树脂Dowex1X8：粒度38μm~75um。17.1.11α-淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。17.1.12
木瓜蛋白酶：酶活力≥10U/mg。17.1.13
碱性磷酸酶：来源于牛肠黏膜，EC3.1.3.1.酶活力≥10U/mg。鸽子肝脏丙酮提取物干粉：酶活力≥0.1U/g。试剂配制
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生理盐水：称取9.0g氯化钠，加水溶解并稀释至1000mL，混匀。临用前于121℃高压灭菌17.2.1
10min，备用。
盐酸溶液：吸取100mL盐酸与50倍水混合。17.2.3乙酸溶液（0.2mol/L）：吸取1.2mL冰乙酸，用水稀释至100mL，混匀。17.2.4
乙酸钠溶液（0.2mol/L）：称取2.7g三水合乙酸钠，加水溶解并稀释至100mL，混勾。5氢氧化钠溶液（2mol/L）：称取8g氢氧化钠加水溶解并稀释至100mL，混匀。17.2.5
乙酸缓冲液（1.0mol/L.pH3.8）：吸取58ml冰乙酸加人800ml水中，用2mol/L氢氧化钠调节pH至3.8土0.1，加水至1000mL，混勾。乙酸缓冲液（1.0mol/L.pH4.5）：吸取58mL冰乙酸加入800mL水中，用2mol/L氢氧化钠17.2.7
调节pH至4.5士0.1.加水至1000mL，混匀。Tris缓冲液：同10.2.4。
碳酸氢钠溶液（0.1mol/L）：同10.2.5。17.2.9
碱性磷酸酶溶液：同10.2.6。
鸽子肝脏提取液：同10.2.10
17.3培养基
乳酸杆菌琼脂培养基：见附录B中B.1。17.3.1
泛酸测定用培养液：见附录B中B.2。17.3.2
17.4培养液的配制
见附录B。
5标准品
D-泛酸钙标准品（C1aH3:CaNO1o，CAS号：137-08-6）：纯度99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
17.6标准溶液的配制
17.6.1泛酸标准储备溶液（400μg/mL）：精确称取435mgD-泛酸钙（精确至0.1mg）.加水溶解并转移至1000mL容量瓶中，加10mL0.2mol/L乙酸溶液、100mL0.2mol/L乙酸钠溶液.用水定容至刻度。贮存于棕色瓶中，加人200μL甲苯，于2℃～4℃冰箱中可保存2年。17.6.2泛酸标准中间液（1.00ug/mL）：准确吸取2.5mL泛酸标准储备液置于1000mL容量瓶中，加人10mL0.2mol/L乙酸溶液、100mL0.2mol/L乙酸钠溶液、用水定容至刻度。加人200uL甲苯，于2℃～8℃冰箱中可保存1年。
17.6.3泛酸标准工作液（20.0ng/mL）：准确吸取2.00mL泛酸标准中间液，置于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混。临用现配。9
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仪器和设备
天平：感量0.1mg。
恒温培养箱：36℃土1℃。
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18.3恒温振荡水浴箱：37℃土1℃，振荡频率100r/min土20r/min。18.4压力蒸汽消毒器：121℃。
涡旋振荡器。
离心机：转速≥3000r/min。
pH计：精度为士0.01。
可见分光光度计。
18.9酶标仪。
超声波振荡器。
微孔板（无菌）：0.36mL，1.1mL。注：所有测试试管使用前洗刷干净，沸水浴30min，沥干后放入盐酸溶液中浸泡2h，经水冲洗后，经170℃土2℃烘干3h后使用。
菌种的制备与保存
19.1菌种
植物乳植杆菌Lactiplantibacillusplantarum（ATCC8014)，或等效菌株。19.2储备菌株的制备
无菌操作条件下将菌种植物乳植杆菌-冻干菌粉转接至无菌乳酸杆菌琼脂培养基中，36℃土士1℃恒温培养20h～24h，使菌种复活。连续传种2次～3次，将培养好的琼脂管作为植物乳植杆菌储备菌株，放入2℃～4℃冰箱中保存。19.3菌株传代与保存
将植物乳植杆菌储备菌株每月至少传代1次，培养并保存新菌株。19.4菌株活化
试验前2d～3d，将最新保存的菌株接种至无菌琼脂管中，36℃土1℃培养20h～24h，以活化菌株，用于接种液的制备
注：如果新菌株保存时间超过2周，试验前宜连续传种2代～3代以保证细菌活力。19.5接种液的制备
试验前一天，取2mL泛酸标工作液（20ng/mL）和4mL泛酸测定用培养液混匀，分装于2支5mL离心管中，塞好棉塞，121℃下高压灭菌15min，冷却至室温，此即种子培养液用接种环将活化菌株接种至种子培养液中，36℃土1℃培养20h～24h。取出离心管，3000r/min离心10min，弃去上清液。无菌操作下加人约3mL已预先无菌化处理的生理盐水，振荡洗涤沉淀，3.000r/min离心10min，弃上清液，用生理盐水重复洗涤一次，再加人约3mL无菌生理盐水，振荡混匀，制成接种液，立即使用。
注：为保证接种液中菌群数量，可另外制备1支种子培养液，同法接种、洗涤，加入生理盐水混匀：以生理盐水为对10
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