【国家标准】 食品安全国家标准 微生物检验方法验证通则

中华人民共和国国家标准
GB4789.45—2023
食品安全国家标准
微生物检验方法验证通则
2023-09-06发布
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2024-09-06实施
术语和定义
微生物检验方法验证一般要求
性能参数的选择
代表性食品的选择
验证样品的要求
数据处理要求
4微生物检验方法性能参数的验证4.1
附录A
灵敏度
包容性和排他性
准确度
微生物检验方法验证用食品样品分类表附录B
附录C
附录D
灵敏度计算方法·
实验室内验证准确度计算方法
实验室间验证准确度计算方法
GB4789.45—2023
1范围
食品安全国家标准
微生物检验方法验证通则
本标准规定了食品安全国家标准微生物检验方法验证的通用要求本标准适用于食品安全国家标准微生物检验方法制定和修订过程中的验证。2术语和定义
2.1方法验证
提供客观有效证据证实分析方法性能参数满足方法预期用途的试验活动2.2
定性方法
检验样品中是否存在目标微生物的方法。2.3定量方法
测定样品中目标微生物数量或浓度的方法2.4参考方法
得到公认或广泛接受的微生物传统培养法2.5灵敏度
待验证的定性方法从样品中检出目标微生物的能力2.6包容性
待验证方法对目标微生物的检出能力2.7排他性
待验证方法对非目标微生物的抗干扰能力。2.8准确度
定量方法的测试结果与样品真值间的J一致程度。
2.9试样
来源于样品，用于测试的且能代表其特性的部分。部分检出水平
GB 4789.45—2023
采用定性方法测试一组平行样品时，检出概率在25%～75%时样品的污染水平。1
CB4789.45—2023
50%检出限（LODsg）
定性方法检出概率为50%时，样品中目标微生物的浓度相对检出限（RLOD）
如果验证时有参考方法，待验证方法与参考方法两者50%检出限的比值配对/非配对分析
2种定性方法同时检验某一样品时，若第一步增菌方法相同，可使用该样品的同一试样进行分析，该分析称为“配对分析”：若第一步增菌方法不同则使用该样品的不同试样分别进行分析，该分析称为“非配对分析”。
微生物检验方法验证一般要求
性能参数的选择
根据待验证方法的类型按表1选择合适的性能参数进行验证。表1性能参数的选择
方法类型
定性方法
定量方法
验证阶段
实验室内验证
实验室间验证
实验室内验证
实验室间验证
灵敏度
注1：“√”表示必选性能参数；“一”表示不适用包容性
排他性
注2：不含确证步骤的定量方法（例如：菌落总数、霉菌和酵母计数）无需验证包容性和排他性。注3：MPN法的验证按照定性方法的验证进行。3.2代表性食品的选择
准确度
3.2.1方法验证时，代表性食品的选择应优先考虑目标微生物和食品样品的特性，再考虑法规限量要求涉及的食品种类或高风险的食品种类。代表性食品的选择参见附录A。选择食品子类时，宜考虑不同的加工方式，每种食品子类应分别进行验证。3.2.2实验室内验证时，如果待验证方法的适用范围为食品”，应至少选择5种食品种类，如果适用范围少于5种食品种类，应全部选择。每种食品种类至少选择1种食品子类3.2.3实验室间验证时，如果待验证方法的适用范围为“食品”，应至少选择3种食品种类，如果适用范围少于3种食品种类，应全部选择。每种食品种类至少选择1种食品子类。3.3验证样品的要求www.bzxz.net
3.3.1样品类型的选择
如果验证时无参考方法，优先选择标准物质或标准样品，其次选择人工污染样品。如果验证时有参考方法，宜按自然污染样品、混合污染样品、人工污染样品、标准物质或标准样品的2
顺序依次选择样品类型。
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注：混合污染样品是指将自然污染样品与不含有自标微生物的同类食品样品进行均匀混合的样品，3.3.2人工污染样品的制备
3.3.2.1培养物的准备
优先选择从食品中分离的菌株，不同食品子类验证用的菌株尽可能分离自相应的食品子类，也可使用其他实验室分离或从菌种保藏机构购买的菌株。所有分离株应经过准确鉴定，且来源应是已知的、可溯源的。
对手含确证步骤的方法的验证，每种食品子类仅需选择1种自标微生物。对手不含确证步骤的定量方法的验证，每种食品子类应选择不同种类具有代表性的微生物，例如，菌落总数的方法验证样品可以选择金黄色葡萄球菌（代表革兰氏阳性菌）、大肠埃希氏菌（代表革兰氏阴性菌）和枯草芽孢杆菌（代表含芽孢细菌）。
按合适的条件培养目标微生物菌株。如果目标微生物有多种，应先分别培养，再进行等量混合。如果样品不含自然背景菌群，必要时可添加背景菌群。背景菌群的污染水平应至少高于目标微生物浓度的10倍，可采用适当的计数方法确认其污染水平符合要求。3.3.2.2样品的人工污染
培养物用稀释液稀释至污染样品所需的合适浓度。如果稀释不能有效去除培养物中的培养基，在稀释前用稀释液漂洗和离心2次3次去除培养基将培养物稀释液添加到样品中时，稀释液体积不能影响样品的状态。当稀释液体积可能影响到样品状态时，应将合适浓度的稀释液制成冻十粉。当冻十粉中自标微生物浓度无法达到制备低污染水平样品所需的浓度水平时，将冻十粉与另外不含培养物的冻干粉混合均匀以稀释至污染样品的合适浓度。宜选取含背景菌群的样品，但应确保样品中不含有目标微生物。将稀释至合适浓度的培养物（稀释液或冻干粉）接种到样品上。样品应混合均匀并确保稳定性。如果样品不易混合均匀，可单独制备每个样品，将每个样品的量缩小为试样的量，整个样品用于测试。用于非配对分析的样品如果不易混合均勾，可以分别制备不同的试样，视为同一个样品。3.3.2.3样品接受参考值的确定
对于无参考方法的验证，可采用适当的计数方法测定所添加的目标微生物的浓度，并换算为样品中目标微生物的浓度作为样品接受参考值。3.4数据处理的要求
方法研制实验室需对所有实验室验证数据进行异常值检验和统计分析，方法可采用格拉布期(Grubbs）检验等统计学方法或技术分析方法。计数结果应转换为常用对数值后，再进行后续计算。4微生物检验方法性能参数的验证4.1灵敏度
4.1.1验证方法
实验室内验证时，至少测试20个平行样品。实验室间验证时，每个验证实验室测试8个平行样品。样品污染水平应为部分检出水平。如果验证时无参考方法，且样品的接受参考值未知时，需按3
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3.3.2.3规定的方法确定样品接受参考值。如果验证时无参考方法，采用待验证方法进行测试；如果验证时有参考方法，分别采用参考方法和待验证方法进行测试。测试时，每种食品子类设空白对照和阳性对照（污染水平是部分检出水平10倍以上）各1个。
本标准中灵敏度用50%检出限（LODs）或相对检出限（RLOD)表示。如果验证时无参考方法，按B,1计算LOD；如果验证时有参考方法，按B,2计算RLOD。4.1.2验证要求
如果验证时无参考方法，待验证方法的灵敏度用LOD表示。定性方法的LODs无接受限，MPN法的LOD。接受限为5CFU。如果MPN法的LOD不超过接受限，则其灵敏度符合要求。如果验证时有参考方法，待验证方法的灵敏度用RLOD表示。对于配对分析，RLOD接受限为1.5；对于非配对分析，RLOD接受限为2.5。如果RLOD不超过接受限，则待验证方法的灵敏度符合要求。
4.2包容性和排他性
4.2.1验证方法
包容性和排他性试验所选用菌株应反映目标微生物和非目标微生物的表型、基因型和（或）血清型的多样性。包容性试验所选用菌株应覆盖目标微生物分类单位及其下一级分类单位（如果有）的种类排他性试验所选用菌株应覆盖自标微生物分类单位外同一级的密切相关的种类，还应包含样品通常含有的优势种类（数量不应超过排他性试验选择菌株总数的1/3）包容性试验需要选择至少30株自标微生物，对于沙门氏菌检验方法的包容性试验，选择不同血清型的至少50株沙门氏菌，应盖主要沙门氏菌血清型。排他性试验至少选择30株非自标微生物直接对纯培养物采用待验证方法进行测试，每个测试中纯培养物的接种量宜为10CFU～10°CFU。
4.2.2验证要求
包容性试验检出目标微生物的测试结果数量与所选择的菌株数量相等，则待验证方法的包容性符合要求。
排他性试验未检出目标微生物的测试结果数量与所选择的菌株数量相等，则待验证方法的排他性符合要求。
4.3准确度
4.3.1验证方法
对于每一种食品子类，应选择低、中、高3个浓度水平。低水平大约是理论检出限的10倍，高水平至少是限量的100倍。如果没有限量，卫生指标菌和致病菌最高污染水平分别设定为约10°CFU/g(mL)和105CFU/g（mL)。
实验室内验证获得重复性条件下的准确度，每个浓度各取2个样品，每个样品分别取5个试样进行测试。
实验室间验证获得再现性条件下的准确度，每个浓度各取1个样品，每个样品分别取2个试样进行测试。
如果验证时无参考方法，采用待验证方法进行测试；如果验证时有参考方法，分别采用参考方法和待验证方法进行测试。测试时，每种食品子类设1个空白对照。4
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实验室内验证和实验室间验证分别按附录C和附录D计算待验证方法的β-期望容忍区间（β-ETI）的上下限，必要时计算新的接受限AL，。4.3.2
验证要求
准确度验证的接受限为士0.5对数值。如果所有样品β-ETI上限U都不高于0.5且下限L都不低于一0.5.则待验证方法准确度符合要求；如果有样品β-ETI上限U高于0.5或下限L低于一0.5，但都不超出AL，则待验证方法准确度也符合要求。
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微生物检验方法验证用食品样品分类表食品种类和食品子类见表A.1。
食品种类
乳及乳制品
冷冻饮品
水果和蔬菜
豆类制品
坚果和籽类
粮食和粮食制品
食品种类和食品子类
巴氏杀菌乳
灭菌乳
发酵乳
冰淇淋、雪糕类
风味冰、冰棍类
新鲜水果和蔬菜
冷冻水果和蔬菜
水果干和干制蔬菜
果脯类、蜜钱类
发酵或腌渍蔬菜
水果和蔬菜罐头
非发醇豆制品
发酵豆制品
新鲜坚果与籽类
熟制坚果与籽类
坚果与籽类的泥（酱）
生湿面制品
即食谷物
熟制面食
方便米面制品
冷冻米面制品
生干面制品
小麦粉
食品子类
焙烤食品
肉及肉制品
水产及其制品
蛋及蛋制品
油脂及其制品
甜味料
调味品
特殊膳食用食品
食品种类
食品种类和食品子类（续）
生鲜肉（禽肉除外）
酱卤肉（禽肉除外）
冻肉(禽肉除外）
发醇肉制品（禽肉除外）
腌腊肉制品（禽肉除外）
肉罐头
生鲜禽肉
熟禽肉制品
冻禽肉
鲜水产
熟制水产品
冷冻水产品
腌制水产品
水产品罐头
卤蛋、皮蛋、咸蛋
蛋制品
植物油脂
动物油脂
油脂制品
香辛料
蛋黄酱、沙拉酱
婴幼儿配方食品
婴幼儿辅助食品
其他特殊膳食用食品
食品子类
GB4789.45—2023
GB4789.45—2023
饮料类
食品种类
可可制品、巧克力和巧克力制品以及糖果8
食品种类和食品子类（续）
鲜果蔬汁(浆)
果蔬汁(浆)类饮料
浓缩果蔬汁(浆）
碳酸饮料
茶(类)饮料
咖啡(类)饮料
固体饮料
可可制品或巧克力制品
巧克力
可可粉或巧克力粉
食品子类
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