【YY医药标准】 医疗器械细菌内毒素试验方法常规监控与跳批检验

ICS11.040.01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0618—2017
代替YY/T0618—2007
医疗器械细菌内毒素试验方法
常规监控与跳批检验
Test methods for bacterial endotoxins of medical devices-Routine monitoring and alternatives to batch testing2017-02-28发布
国家食品药品监督管理总局
2018-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草YY/T0618—2017
本标准代替YY/T0618一2007《细菌内毒素试验方法常规监控与跳批检验》，与YY/T0618—2007的主要区别如下：
标准名称修改为：医疗器械细菌内毒素试验方法常规监控与跳批检验；
修改了范围：
增加了术语，内毒素工作标准品（见3.4）；几何平均终点（见3.11）；调查试验（见3.14）；超限值（见3.21）：
修改了“附录B
3试验方法、常规监视和跳批试验指南”；增加了“附录C走
超限值（OOS)和失败调查指南”。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口。本标准起草单位：山东省医疗器械产品质量检验中心、国家食品药品监督管理局天津医疗器械质量监督检验中心、上海松力生物科技有限公司。本标准主要起草人：孙令骁、王昕、朱丽丽、姜华、何红兵、吴旭君。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：YY/T0618—2007
YY/T0618—2017
热原是任何可以引起发热的物质。许多医疗产品的放行需要进行热原试验。热原可分为两类：微生物热原（如，细菌、真菌、病毒）和非微生物热原（如，药物、器械材料、类固醇、血浆制品）。已发现的热原大多数为革兰氏阴性细菌的内毒素。虽然革兰氏阳性细菌、真菌和病毒可能是致热原，但它们的致热机理不同（全身作用）并且作用程度低于革兰氏阴性细菌。本标准只包括革兰氏阴性细菌内毒素试验内毒素是革兰氏阴性细菌细胞外壁的高分子量脂多糖（LPS）成分，如污染人体血液或组织，内毒素可导致发热、脑膜炎和血压迅速降低。当革兰氏阴性细菌分解或裂解时，主要由蛋白、磷脂和LPS组成的细胞外壁成分就不断释放人环境中。内毒素污染难以预防，因为其广泛存在于自然界中，性质稳定，体积较小可通过常规的除菌滤膜。可通过下列措施使医疗产品具有无热原性：1）采用预防或控制内毒素聚集的生产技术；2）通过内毒素灭活（如干热法)或物理去除方法（如清洗、蒸馏、超滤)去热原。本标准主要关注无需将去热原步骤作为生产过程一部分的条件下生产的产品。本标准的目的是提出细菌内毒素试验的要求和指南。包括供试验产品单元的选择，试验技术的选择和确认，常规试验技术的使用以及试验结果的解释。本标准还包括了用于支持选择跳批试验的生产运行确认要求。
附录A.附录B和附录C中分别包含以下信息：内毒素试验的背景和历史（参见附录A)；一内毒素试验方法指南（参见附录B）；跳批试验和生产过程确认指南（参见附录B)；一超标结果试验结果和调查指南（参见附录C）。Ⅱ
HiiKAoNiKAca
1范围
医疗器械细菌内毒素试验方法
常规监控与跳批检验
YY/T0618—2017
本标准规定了适用于测定医疗器械，组件或原材料的细菌内毒素试验方法的基本准则注：虽然本标准的范围限定为医疗器械，但本标准规定的要求和给出的指南可能也适用于其他医疗产品。本标准不适用于细菌内毒素以外热原的评价2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件中华人民共和国药典2015年版
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
细菌内毒素试验bacterial endotoxinstest;BET通过将液体试验样品与鲨试剂混合来测定活性细菌内毒素的检验，通过目测、浊度、显色或其他确认过的检验方法测量成正比例反应的结果。3.2
批batch
规定的原材料，中间体或成品的数量，预期或声称其在规定的生产循环中生产的特性与质量均一。3.3
显色技术
chromogenic technique
基于测量的显色反应正比于鲨试剂与内毒素之间反应的原理，定量或检测内毒素的BET方法。3.4
内毒素工作标准品
control standard endotoxin;CSE以国家标准品为基准标定的内毒素制剂。3.5
除热原depyrogenation
确认过的去除或灭活内毒素的过程。3.6下载标准就来标准下载网
内毒素或细菌内毒素endotoxinorbacterial endotoxin与革兰氏阴性菌细胞壁有关的高分子量复合物，有人体致热性并与鲨试剂有特异性反应3.7
内毒素单位
endotoxin unit
内毒素活性的标准测定单位。
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终点（凝胶）endpoint（gelclot）个试验溶液的系列稀释或系列浓度或对照溶液中观察到一个细菌内毒素阳性反应的最后个点。
增强enhancement
非内毒素相关因素（通常由试验样品的特性所致)导致的细菌内毒素试验异常现象，使试验反应高于实际存在的内毒素总量。
gel-clottechnique
凝胶技术
量化或检测内毒素的BET法，基于产生的凝胶反应是鲨试剂与内毒素呈正比反应的原理。3.11
几何平均终点
geometricmean endpoint
从重复系列稀释度中得到的已转换为以10为底的终点对数值的平均值，用于从某一试验溶液确定集中趋势或均值。
抑制inhibition
非内毒素相关因素（通常由试验样品的特性所致）导致的细菌内毒素试验异常现象，使试验反应低于实际存在的内毒素总量。
抑制/增强试验inhibition/enhancementtest用于确定某一特定细菌内毒素试验样品是否含有减小试验准确性的因素，即是否对试验系统产生抑制或增强作用的试验。
investigation test
调查试验
重新分析某一样品浸提液或制备液以验证原试验结果3.15
萤试剂反应材料LALreactivematerial：LAL-RM任何激活鲨试剂并引起增强的非内毒素成分。3.16
内毒素检查用水LALreagentwater：LRW纯化水或其他经鉴定的可用于BET中的溶剂、稀释剂和/或浸提液，在所用方法中应无反应和无干扰。
灵敏度lambda
鲨试剂凝胶试剂的标称灵敏度，以EU/mL表示。或，对于显色法和浊度法，参照标准曲线的最低点（内毒素浓度）。
萤试剂limulus amebocyte lysate;LAL从鲨（horseshoecrab）［美洲（Limuluspolyphemus）或中华鲨（Tachypleustridentatus）的循环2
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血变形细胞中提取的试剂，与内毒素相互反应产生凝胶，用于细菌内毒素试验测定细菌内毒素水平。3.19
脂多糖lipopolysaccharide;LPs革兰氏阴性细菌细胞壁成分，典型的由脂质A、核心多糖和O-侧链组成。3.20
最大有效稀释倍数
maximumvaliddilutionMD
与BET的灵敏度相关的能够检出规定的试验内毒素限值的样品最大稀释量。3.21
超限值outof specification；Oos样品有效BET试验结果超出产品内毒素限值的规范。注：术语OOS只适用于本文件，与其他涉及OOS结果的法规指南有所不同，如美国食品药品监督管理局（FDA）的《药品生产OOS试验结果的研究》。3.22
无热原性
non-pyrogenic
医疗产品不会引起发热反应。
vuonge
注：也可用于描述和标示医疗产品的内毒素水平低于规定的限值。3.23
产品内毒素限值productendotoxinlimit规定的某一产品内毒素的最大可接受水平。3.24
产品实现
productrealization
要求的全过程
开发、生产和成品交付符合质量管理体3.25
pyrogen
任何能产生发热的物质。
热原的pyrogenic
医疗产品能够引起发热反
注：可用于描述医疗产品内毒素水平超过规定的限值。3.27
内毒素国家标准品
reference standard endotoxin; RSE中华人民共和国药典中规定的从大肠杆菌提取精制而成的内毒素制剂。3.28
再试验retest
对先前的供试批的追加样品进行试验。3.29
标准对照系列standard control series用于验证有效的内毒素灵敏度的RSE或CSE系列稀释液。3.30
试验内毒素限值
test endotoxin limit
浸提液中所允许的最大内毒素浓度。该确定的限值用于计算样品浸提（混合或一个单元）的最大有效稀释倍数。
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注：该限值由产品内毒素限值除以每单位样品浸提液的所用LRW的体积来确定3.31
turbidimetric technique
浊度技术
定量或测定内毒素的BET方法，基于测量的显色反应是鲨试剂与内毒素呈正比反应的原理。3.32
确认validation
建立获取，记录，解释结果的文件化程序从而保证产品符合预定规范的结果，4质量管理体系原理
4.1文件形成
4.1.1应详细说明细菌内毒素试验步骤。4.1.2本标准中要求的文件和记录应经过指定人员的评审和批准（见4.2.1），并且应在规定的质量管理体系要求的控制下。
4.1.3质量管理体系要求中应规定保留原始数据、计算和衍生数据以及量参与样品制备和检验的人员的信息。各数据记录。记录中应包括
使用利作的相关设备。
所使用的检验技术步骤和说明是获得批准的：应具备所有仁4.1.4计算和数据传递应被适当控制。如采用电子数据，所更用的软件应进行确认并保存确认记录。4.2
管理职责
应详细说明完成和进行本文件中所措述的步骤的责任和权利。责任应赋予符合质量管理体系4.2.1
要求的人群
4.2.2如果具有单独质量管理体系的组本标准的要求，应详细说明每一人员的责任和权利。4.3
3产品实现
应详细说明采购的步骤
4.4人员
步骤应与质量管理体系要求一致。4.4.1质量管理体系要求中应规定指派进行细菌内毒素试验人员的职责。4.4.2应按形成文件的程序进行培训，应保留技术人员的相关认定、培训和经历的记录。4.4.3分析人员在从事细菌内毒素试验之前应对其进行认定（见8.3.2）。4.5设备
4.5.1应具备正确进行规定试验所需的所有设备，并按形成文件的程序进行经策划的维护和校准。应保留维护和校准记录
4.5.2所有设备应按规定准则的文件进行操作。4.6试剂和材料
4.6.1应规定细菌内毒素试验中所用的材料制备方法，包括相应的鉴定试验。注：相应的鉴定试验包括鲨试剂灵敏度的认定。4.6.2试验中使用的所有鲨试剂应是经过许可的。4
iiiKAoNhikAca
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4.6.3细菌内毒素试验所用玻璃器血和其他设备的除热原方法应得到建立，确认并形成文件。4.6.4细菌内毒素试验所用材料如未经除热原处理，应证实无可检出内毒素。证实的方法例如，通过检验购买的材料样品或通过查验售方的合格证明确认无热原。注：制样、贮存或稀释的容器宜无干扰因素。4.7测量、分析和改进
程序中应规定不正常、非预期或超限值结果的处置要求，包括纠正和预防措施。这些程序应符合质量管理体系要求。超限值和失败调查的指南参见附录C。5无热原标签
5.1直接或间接与血管内、淋巴内或鞘内接触的产品，或是可能与类似全身接触的产品（如输液器、转移器、导管、植人物和输液组件）、或是眼内使用的眼科产品（如硅油、黏弹性产品，眼内透镜）应评价内毒素。
5.2满足内毒素限值要求的产品可给出声称无热原的标签注：产品通常不标示无热原，因为无热原意味着绝对不含细菌内毒素。而所有BET方法的固有检出限都无法使试验证实绝对不含有细菌内毒素。5.3任何采用标识标称无热原的产品应具有确切的证明，这些证明可包括：一由经认定的人员采用确认过的细菌内毒素试验直接检验产品；一生产过程生产出无热原的产品的形成文件的确认：或符合某一适用标准和/或要求的其他证据。5.4试验过程中应包括声称无热原的产品的所有组件。豁免包装内任一产品件都宜形成文件（如某一把手或束带）。声称“无热原的液路”应通过对所用液路的相关组件和表面的适当评价来予以支持5.5对于多组件的套装类产品，其标签和声称应与包中与循环、淋巴或脑脊液系统接触组件的形成文件的评价相一致。这一标签宜与包及其组件的预期临床应用相一致。5.6应依据适宜的法规要求测定产品内毒素限值。注：GB/T14233.2一2005中推荐给出了医用输液（血），注射器具的内毒素限值。6产品单位选择
6.1细菌内毒素试验中产品单位选择的抽样准则是以生产过程受控并且符合质量管理体系要求为前提。
6.2试验产品单位的选择应基于抽样方案中规定的准则，这一准则可基于法规的要求，已公布的统计学方案或指南，或生产运行的确认。6.3抽样母体（group）一般规定为生产批。如有数据支持不同的选择基数或选用跳批检验，样本选择可基于抽样母体不是一个生产批。如选用跳批检验，见第10章、B.6～B.8和B.10。注：抽样母体不是一个生产批的抽样规范中宜包括风险评定，以评价用于建立抽样母体准则的适宜性（参见附录B)。6.4检验样本宜在成品中选取，这包括了所有可能影响或提高内毒素水平的因素（例如，包装）。注：用于内毒素检验的样品可从被其他生产质量项目中拒收的产品中抽选，前提是该拒收样本能代表非拒收产品。6.5样本可包括灭菌前和灭菌后产品。灭菌后的样本包含了所有可能影响产品或内毒素试验的因素。如选择灭菌前的样品检验，样本代表最终产品内毒素水平的可接受性应形成文件。所开展的检验程序宜持续反映灭菌前或灭菌后的样本。等同性确认指南参见B.6.55
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注：对于促微生物生长的产品，选择灭菌前的样品可能不合适6.6在多组件套装类产品（程序包）或成套产品检验中，依据该产品的使用情况的不同，有时可对每一组件单独评价，有时则可将所有内装物视为一个整体器械评价。标准试验程序宜适用于每一组件的情况。将成套产品或套装作为一个独立单元时，应在不改变方法的前提下考虑样品制备和适用的产品内毒素限值。更多指南参见B.6.6。7技术的选择
7.1检验实验室当前有三种细菌内毒素检验技术可供选择。每一技术的选择宜建立在实验室技能、经验、样品量要求、数据处置要求和试验样品性质之上的充分评定。当前技术和方法包括：a）凝胶技术：限值试验和测定方法；b）显色技术：动力学和终点方法；c）浊度技术：动力学和终点方法。三种方法的信息参见附录B。
7.2所选方法应按第8章进行确认。如改变试验方法或技术，应进行确认/验证（见8.6）。8方法学确认
8.1试验内毒素限值鉴定
8.1.1试验内毒素限值定义为某一产品浸提液中可能存在的内毒素最大允许浓度，它与产品内毒素限值相关。参见附录B，确定产品内毒素限值。8.1.2一旦确定了产品内毒素限值，试验内毒素限值可按式（1)计算：医疗器械试验内毒素限值（EU/mL）：式中：
K—每一器械内毒素允许量（产品内毒素限值）；N
供试器械数量；
样品组合中的浸提液总量，单位为毫升（mL）。最大有效稀释倍数（MVD)
8.2.1产品有时可能干扰细菌内毒素试验（抑制/增强）。通常采用内毒素检查用水（LRW）或其他适宜稀释剂稀释产品浸提液的方法减轻干扰。因为稀释也会对可能存在的内毒素稀释，因此要有一个允许稀释限度。最大有效稀释倍数按式（2)计算：MVD=试验内毒素限值
式中：
试验内毒素限值，见式（1）：
入一经认定的鲨试剂标示灵敏度（凝胶法）或用于绘制参照标准曲线（显色和浊度）的最低内毒素浓度。
该MVD值表示了基于鲨试剂灵敏度的克服抑制/增强作用所能进行的稀释倍数。如MVD为4，即按不大于4倍的比例稀释样品浸提液不影响检测产品内毒素限值的能力。如可行，宜在低于最大有效稀释的稀释度下对产品进行确认。6
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8.2.2如某一产品按MVD进行试验，宜将该内毒素试验视为定性试验。结果表述为通过/不通过，阳性结果表明产品的内毒素含量超出了规定的内毒素限值。阴性结果则表明通过该试验8.2.3当一产品在低于MVD的稀释度进行试验时，可能需要进行附加稀释以确定阳性结果是否满足试验要求。可采用稀释来获得某一有效的试验结果。附加稀释可能不需要确认。除水以外的稀释剂在使用时可产生干扰作用，宜进行再确认。8.3试剂和分析人员资质认定
8.3.1预试验（标示值的认定/线性的证实）8.3.1.1凝胶技术用预试验
应通过检验对每批鲨试剂的标示灵敏度（a）进行验证。该试验应在4个2倍稀释系列（例如：2入、入、0.5入0.25入的稀释度）和一个阴性对照中进行。该稀释系列的几何平均终点应在0.5入～2入的范围内。一旦被认定，标示灵敏度用于所有计算。标示灵敏度的几何平均值按式（3)计算：几何平均值=antilg（2e/F）
式中：
Ze各稀释度内毒素反应终点浓度的对数值之和；F——重复数。
8.3.1.2显色/浊度技术用预试验.+.
·*（3）
验证需证实线形标准曲线跨越常规分析中所用的内毒素稀释范围。应至少用3个不同的内毒素浓度建立标准曲线。如标准曲线范围大于2个1g，宜在曲线范围内每增加1个1g，增加一个标准。各内毒素浓度宜进行3个平行试验。在初次质量控制试验中，不宜取各点的均值来计算线性，线性要求与鲨试剂生产商标示的内毒素浓度范围的相关系数的绝对值|≥0.980。如标准曲线范围小手2个1g.建议用2倍稀释建立标准曲线。如果标准曲线大于2个1g，宜用10倍稀释建立标准曲线，且在该标准曲线范围内每增加1个Ig插人一个标准。标准曲线不宜超过4个lg，因为大于5个1g或以上的曲线是不合适的，会产生假阴性结果。在试剂鉴定中确定的该标准曲线范围，将用于常规检验。8.3.2分析人员资质认定
每个从事细菌内毒素试验的分析人员应进行能力确认，分析人员的能力确认程序与8.3.1预试验所规定的程序相同。
8.4产品鉴定/确认
8.4.1总则
每一产品或产品母体（参见B.6.3）应经过鉴定/确认，以充分证实试验样品自身对细菌内毒素试验系统不会产生抑制、增强，否则会对BET的准确度和灵敏度有于扰作用。样品干扰信息见8.5。每个产品或每一类产品至少应使用三批进行初次鉴定/验证研究。8.4.2和8.4.3给出了产品鉴定的方法8.4.2凝胶技术
8.4.2.1按表1制备溶液。样品溶液稀释度应小于或等于MVD，且试验系统中不应含有任何可检出的YY/T0618—2017
内毒素。试验各内毒素加人量的稀释系列和阴性对照。各内毒素加人量稀释系列的几何平均终点浓度应按8.3.1预试验所列公式测定[式（3）]。表1
抑制/增强试验用溶液的制备（凝胶技术）溶液
产品阳性对照（PPC）
产品阴性对照
标准对照系列
阴性对照
稀释液
样品溶液
样品溶液
如果是下列情况，样品不含有干扰因子：内毒素加人量
制备2入溶液、然后
最初的2入制备液2倍
系列稀释
制备22溶液、然后
最初的2入制备液2倍
系列稀释
产品阳性对照系列的鲨试剂灵敏度在0.5入～2入之间；阴性对照显示无反应；且
标准对照系列的结果与鲨试剂标示灵敏度相符显色技术和浊度技术
内毒素浓度
平行数
在内毒素标准曲线上选择中值附近的内毒素浓度。按表2所列制备溶液，样品溶液的稀释度应小于或等于MVD。
表2抑制/增强试验的溶液制备（显色技术和浊度技术）溶液
产品阳性对照（PPC)
样品溶液
标准对照系列
阴性对照
稀释剂
样品溶液
样品溶液
内毒素加人量
标准曲线中值浓度
最少3个不同浓度
最少平行管数
每浓度2
从产品阳性对照中减去样品溶液的平均内毒素浓度，计算出加人的内毒素平均回收率。8.4.3.3如产品阳性对照测得浓度（减去样品溶液检出内毒素浓度后）在已知加入的内毒素浓度的50%～200%内，则认为样品或样品稀释液无干扰因子。8.5样品干扰
如细菌内毒素试验中出现干扰现象，可对样品浸提液采用稀释和/或适当处理来去除抑制或增强作用。
8.6鉴定/确认的保持
采用三批确认的自的是测定产品引人的干扰因子的存在或其变异性。在下列情况下应取三批
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