【YY医药标准】 组织工程医疗产品 第25部分:动物源性生物材料DNA残留量测定法:荧光染色法

ICS11.040.40
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0606.25--2014
组织工程医疗产品
第25部分：
动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法
Tissueengineeredmedical product--Part25：Quantification of remnant DNA in biological materials utilizing animaltissues and their derivatives: Fluorescence method2014-06-17发布
国家食品药品监督管理总局
2015-07-01实施
YY/T0606《组织工程医疗产品》已经或计划发布以下部分：第2部分：术语；
第3部分：通用分类；
第4部分：皮肤替代品（物）的术语和分类；第5部分：基质及支架的性能和测试；第6部分：I型胶原蛋白：
第7部分：壳聚糖；
-第8部分：海藻酸钠；
第9部分：透明质酸钠；
第10部分：修复或再生关节软骨的植人物的体内评价；第12部分：细胞、组织、器官的加工处理指南；第13部分：细胞自动计数法；
第14部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：ELISA法；第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖试验：第16部分：保存指南；
第17部分：外源性因子评价指南；第18部分：海藻酸盐凝胶固定或微囊化指南：第19部分：修复和替代骨组织植人物骨形成活性的体内评价指南：第20部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：细胞迁移试验；第24部分：可吸收生物材料植人试验评价规范；第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法；第26部分：聚合物支架微结构评价指南。本部分为YY/T0606的第25部分。本部分按GB/T1.1—2009给出的规则起草。YY/T0606.25—2014
请注意本部分的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由中国食品药品检定研究院归口。本部分起草单位：中国食品药品检定研究院。本部分主要起草人：徐丽明、陈亮、邵安良。YY/T0606.25—2014
由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性支架材料被普遍用于外科的创伤修复，肌腱、皮肤、心血管、胃肠及下尿道组织的重建。这些细胞外基质支架材料取材于人和动物的各种组织，如：猪的皮肤、角膜、小肠、尿道及膀胱，牛的皮肤，人的皮肤等。由于细胞膜的表位抗原、同种异体或异种的DNA以及由损伤而来的小分子物质可能会引起人体广泛的免疫反应，因此动物源性基质材料的脱细胞过程被认为是非常重要的。尽管细胞外基质材料已经被广泛用于临床，但仍然存在由于残留DNA及残留蛋白质等所引起的炎症和免疫反应隐患。因此，动物源性生物材料中，残留DNA定量检测是控制产品质量的重要措施之一。目前，国际上还没有对该类产品残留DNA的检测方法标准。美国的FDA也没有对动物源性生物材料残留DNA限量的具体规定。使用动物源性生物材料的医疗器械成为动物源医疗器械。国际标准化组织发布了动物源医疗器械系列标准（ISO22442-1：2007），我国已于2008年等同转化为“动物源医疗器械”行业标准。此标准包括第1部分“风险管理应用”；第2部分“来源、收集与处置的控制”第3部分“病毒和传播性海绵状脑病（TSE》因子去除与灭活的确认”。我国于2009年出台了“动物源性医疗器械产品注册申报资料指导原则”（食药监办械函[2009]519号）。对动物源性医疗器械产品注册申报资料的要求中提到，注册申报资料在满足一般性要求的基础上，需要增加涉及控制病毒和/或传染性病原感染以及免疫原性风险方面有关的技术内容。其中要求提供对清除（或降低）动物源性材料免疫原性工艺过程的描述、质量控制指标与验证性实验数据或相关资料。对于动物源性材料带来的免疫原性风险的降低，一般采用在生产工艺中降低其免疫原性的方法，包括脱细胞、去除杂蛋白，以及使蛋白质变性等物理的和/或化学的处理步骤，移走或覆盖抗原决定簇。生产企业需对其降低材料免疫原性的有效性进行验证。其中验证手段之一就是检测残留DNA含量。基于生物制剂残留DNA检测方法主要包括DNA探针杂交法及荧光染色法（《中华人民共和国药典》2010年版三部，附录IX-B外源性DNA残留量测定法），其中荧光染色法操作简便、灵敏度高、再现性好，得到广泛使用。然而：a）动物源性生物材料来源于动物或人的组织（主要是基质组织），经脱细胞等工艺制作而成，大多为固体状态（有的为胶体或液体状态），不能直接采用上述方法检测；b）基质组织中含有大量的结构蛋白质，影响荧光测定的结果。所以，生物制剂残留DNA检测方法不能直接用于动物源性生物材料残留DNA的定量检测。本标准将阐述适用于动物源性生物材料残留DNA的定量检测方法。I
1范围
组织工程医疗产品第25部分：
动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法
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YY/T0606的本部分适用于动物源性生物材料及其衍生物的终产品或中间产品、用于组织工程医疗产品基质或支架的动物源性支架材料，也可用于人源性材料。本部分所述试验方法用于动物源性生物材料的残留DNA定量检测。待检测样品的DNA残留量在本部分所述方法的检测灵敏度之内的检测结果有效。针对每一特定的样品，试验条件的设定是否合理需要有适当的方法学验证。除本标准所选方法外，可采纳其他等效方法实施本部分的使用者应建立相应的安全和健康条例，并规定管理条例的适用性。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。中华人民共和国药典2010年版三部3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
基质matrix
组织工程医疗产品中作为细胞或生物分子生长、支持或输送载体的原材料，可以是高分子合成物质，也可以是生物组织的细胞外基质（matrix)来源的生物源性物质。3.2
scaffold
促进替代，修复或再生组织的细胞或生物活性因子迁移、结合或输送的支持物、释放载体或基体许多有机物（生物源性物质）、无机物及高分子物质都可以用作组织工程医疗产品的支架材料。3.3
动物animal
任何脊椎或无脊椎动物[包括两栖动物、节肢动物（如甲壳纲动物）、鸟、珊瑚、鱼、爬行动物、软体动物和哺乳动物]，不包括人（智人）。3.4
衍生物
derivates
通过制造工艺从动物源性材料中获得的物质。例如：透明质酸、胶原、明胶、单克隆抗体、壳聚糖、白蛋白等。
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化学交联chemical cross-linking通过化学方法，如化学键的结合，使化合物现稳定状态。动物源性基质材料多采用脱细胞处理和/或结合化学交联方法，达到移走或覆盖抗原表位，DNA及损伤断裂的小分子物质，从而减少和控制由这些残留物质引起的免疫原性风险。4样品、试剂和器材
4.1样品
对于由于生产工艺中采取了化学交联等工艺，终产品不易被酶类（蛋白酶K、胰酶等）消化的样品，应使用化学交联等工艺前的中间产品。注：如果需要对化学交联后不易被酶类消化的终产品进行DNA残留量检测，可采用材料浸提液进行后续实验。但是，结果只能反映可浸提的DNA残留量，不能代表被检品的实际DNA残留量。此时应对浸提条件作具体规定。
4.2试剂
蛋白酶K消化用试剂
蛋白酶K（一20℃保存，避免反复冻存和融化）、蛋白酶K缓冲液。4.2.2
2DNA纯化用试剂
磁珠（4℃保存）、裂解液、DNA结合液、漂洗液、溶出液（室温保存）。注1：可选择使用核酸精制试剂盒，例如“PrepSEQTMNucleicAcidExtractionKit”注2：可选用其他同等效果的试剂盒，也可采用传统的酚氟仿抽提/乙醇沉淀法，但需要验证其回收率、灵敏度及可重复性，确保能够满足实验的要求。4.2.3荧光染色法检测试剂
本部分验证实验所用试剂盒为\Quant-ITPicoGreendsDNAReagentandKits”。注：选用其他双链DNA荧光染料时，按试剂使用说明书配制。4.2.4其他试剂
回收率试验用标准品LambdaDNA、DEPCwater、3%BSA。注：DEPC水（DEPCtreatedwater）：用焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC)处理过并经高温高压灭菌的微滤（MiliQ）纯净水。经检测证实不含核酸分解酶（RNase、DNase）和蛋白分解酶（proteinase）。DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其他各种要求无核酸分解酶和蛋白分解酶的反应体系。
4.3器材
4.3.1磁力架。
96孔板（黑色）。
荧光酶标仪。
DNase-free无菌离心管；吸头。冷冻离心机。
真空干燥器。bzxz.net
4.3.7震荡器。
漩涡混悬器。
高精度天平（0.0001g）。
5试验过程
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实验方案的设计主要依据《中华人民共和国药典》2010年版，三部，附录IX-B外源性DNA残留量测定法及参考文献。
本部分所采用的实验方案包括三个步骤：a）动物源性生物材料的消化处理，如：蛋白酶K消化（适用于固体或胶体状材料）；b）消化后样品的DNA纯化（如：磁珠吸附法）；纯化后样品的DNA残留量测定（荧光染色法）。试验样品除供试品之外，需同步设定回收率试验样品（可使用标准品LambdaDNA）。因动物源性生物材料以胶原纤维等结构蛋白为主要组成成分，其对荧光染色法DNA测定有较强的干扰作用，因此本试验方法设定对供试品DNA做进一步纯化以排除干扰，保证精密度和回收率试验均符合要求。每次测定均应从一开始的消化步骤起增加回收率实验，并用回收率方程对测定结果进行校正。
试验过程中应采取防止DNAase污染的措施，如：戴手套操作、使用没有DNAase污染的专用实验台和实验用具及仪器。
以下将以蛋白酶K消化、磁珠法DNA纯化、PicoGreen荧光染色三步法为例叙述试验步骤。5.2试验步骤
5.2.1消化处理
5.2.1.1供试品及反应液的准备
每份样品设三个平行样。取供试品精确称重并记录，放进1.5mLDNase-free无菌离心管内。注1：于燥型样品：取供试品精确称重并记录，放进1.5mLDNase-free无菌离心管内，用无菌眼科剪将样品剪裁成适当大小，加DEPC水至预先设定的体积，于4℃冰箱内放置12h～24h，使样品充分水和、软化。注2：湿润型样品：取供试品，放进1.5mLDNase-free无菌离心管内，13000r/min离心10min.去除液体部分。另取与上述同样大小的样品，冻干或真空干燥后精确称重并记录，用于样品干重单位重量内DNA残留量的计算。
注3：胶体型样品：称取供试品，放于1.5mLDNase-free无菌离心管内，如果后续的DNA纯化时裂解液的加人能够使胶体型样品分解，则可省略蛋白酶K消化步骤，直接进行下一步实验。注4：骨质类样品：对于诸如同种异体骨等骨植人物样品应参照GA/T383一2002的要求对供试品进行脱钙处理。待脱钙完全，组织变软后再进行蛋白酶K消化处理，注5：测试样品不限于上述种类。液态状样品不需要蛋白酶K消化，可直接进行后续的DNA纯化试验，注6：不含DNA分解酶（DNase-free》：经过特殊处理，已证实不含DNA分解酶。本实验实施过程中所用的所有和样品直接接触的离心管、吸头、移液管等器材均需保证不含DNA分解酶，以便防止样本中残留DNA被分解而不能正确地检测到，
将上述供试品剪成尽量小的碎片后，加蛋白酶K缓冲液（10xProteinaseKbuffer）20μL，蛋白酶K（20mg/mL)10μL，加DEPC水至最终反应体积为210μL。5.2.1.2回收率样品及反应液的准备取DNA标准品（LambdaDNAstandard），如：400ng、200ng、100ng、50ng、25ng.0ng，用DEPC3
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水稀释至100μL，分别加在1.5mLDNase-free无菌离心管内，添加蛋白消化酶K缓冲液20μL，蛋白酶K（20mg/mL）10μL，3%BSA80μL（目的是保证与供试品反应系统相同），至最终反应体积为210μL
注：标准品DNA样品系列浓度的设定应根据待检测样品DNA含量的大致范围（参照生产厂家的自检信息或预试验结果），保证待检测样品DNA含量在回收率曲线样品DNA添加量的范围之内。5.2.1.3蛋白酶K消化
将上述供试品和回收率样品反应液分别混勾后放在56℃水浴槽内消化，至待检测样品完全消化，无肉眼可见颗粒样物为止（消化所需时间因样品不同而异）。注：以上反应条件及反应体积可依据样品特点进行优化、调整。消化处理不限于使用蛋白酶K消化，消化条件需要针对所选择的方法进行优化设计。5.2.2DNA纯化
5.2.2.1依据所选择的方法及使用的试剂盒所附的操作方法进行DNA纯化。示例：使用PrepSEQT核酸提取试剂盒（PrepSEQTMNucleieAcidExtractionKit）进行DNA纯化注：如果使用其他试剂盒请按说明书操作。5.2.2.2在上述各样品反应液中分别加入裂解液400μL，震荡10s使样品充分混匀，室温放置10min，使样品完全溶解（最多可放置1h～2h，直至样品完全溶解）。5.2.2.3取出装有磁珠的离心管，震荡10s混匀后，取30μL磁珠液分别加人上述各样品内，震荡10s混勾。
5.2.2.4加人400μL结合液（异丙醇），震荡5s。5.2.2.5室温下震荡（1000r/min）孵育10min。5.2.2.6再次震荡10s后，将内装样品的离心管放在磁力架上，收集结合有DNA的磁珠，去除上清液。5.2.2.7漂洗DNA：加人3COμL洗液，震荡10s后，将内装样品的离心管放在磁力架上，收集结合有DNA的磁珠，去除上清液。
5.2.2.8重复步骤5.2.2.7，漂洗DNA，至少2次。5.2.2.9使结合有DNA的磁珠在室温下干燥5min。5.2.2.10溶出DNA：加人50μL溶出液，震荡5min，于70℃水浴槽内孵育5min，震荡2s后，将内装样品的离心管放在磁力架上，分离DNA。5.2.2.11转移上清部分（含有纯化DNA）至新的1.5mLDNase-free无菌离心管内，标记为纯化后DNA。
5.2.2.12重复溶出DNA：加人50L溶出液，重复5.2.2.105.2.2.11，共2次。将三次溶出液充分混合，最终获得纯化DNA总量150μL。注1：纯化后的DNA样品应立即使用或储存在适当的条件下（一20℃保存），确保其在后续试验时的稳定性。应避免反复的冻存和融化。
注2：可取纯化后的DNA进行凝胶电泳实验，用于检测DNA断片的大小。5.2.3DNA含量测定（荧光染色法）使用5.2.2中步骤5.2.2.12的纯化DNA样品进行DNA含量测定。5.2.3.1
5.2.3.2DNA标准曲线组样品的准备：标准品溶液的配制：用1XTE缓冲液将DNA标准品配成0ng/mL、2.5ng/mL.5ng/mL、10ng/mL.20ng/mL、40ng/mL.80ng/mL的标准品溶液各400μL。将稀释好的标准品溶液每孔125uL加人96孔黑色酶标板内，每份样品设3个复孔。5.2.3.3回收率实验样品及供试品的准备：取回收率实验DNA纯化样品和供试品DNA纯化样品，加人1×TE缓冲液进行适当的稀释，得到稀释液400pL，取每孔125μL加人到96孔黑色酶标板内，每份4
样品设3个复孔。
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注：回收率实验DNA纯化样品和供试品DNA纯化样品的稀释倍数可以调整，应尽可能保证其反应后荧光强度值在标准品溶液反应后荧光强度值范围内（小于80ng/mL反应后荧光强度值）。5.2.3.4分别于上述各样品中添加PicoGreen反应液125μL（与样品等体积混合），震荡混匀后室温避光反应5min，用荧光酶标仪测定。测定条件：以480nm为激发波长，520nm为发射波长，530nm为截止波长进行测定，以所得数据作图分析并求得回归方程。以1XTE缓冲液为样品测得的荧光强度值为本底，测定和记录各测定孔的相对荧光强度值（RFI)。注1：该荧光测定法DNA检出限为0.3ng/mL，DNA含量在1.25ng/mL~80ng/mL范围线性较好，因此供试品DNA含量在该范围内可定量测定；当DNA含量低于1.25ng/mL时应为限量测定，表示为小于1.25ng/mL，此时应减少样品的稀释倍数后重新测定。注2：PicoGreen反应液：由PicoGreen原液以1×TEBuffer稀释200倍配制。注3：1×TEBuffer：由20×TEBuffer以DEPC水稀释配制。6结果计算
首先对标准品和回收率试验样品及供试品进行5次重复测定，获得相对荧光强度值：取五次测定6.1
的RFI值平均数，并减去本底（只有TE，无DNA时测得的RFI值）；利用标准品测定值（RFI值）为纵坐标（Y），添加量（ng/mL）为横坐标（X），绘制标准曲线，获得回6.2
归方程：
1=(y-a1)/bi,R,2
式中：
添加量，单位为纳克每毫升（ng/mL）；测定值，无单位；
常数；
b.常数；
R，相关系数。
6.3将回收率试验DNA纯化样品和供试品DNA纯化样品所测得的RFI值分别减去回收率试验“0ng\样品的RFI值，再分别代人标准曲线回归方程的y，求得各样品的工，即为DNA含量实测值(c:ng/mL);
6.4通过DNA含量实测值，获得实测DNA质量；m=exV
式中：
实测DNA质量，单位为纳克（ng)；DNA含量实测值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；测试前的反应体积，单位为毫升（mL）。通过实测DNA质量，获得纯化后样品DNA总量；式中：
m post
mpt=mXV/V2
实测DNA质量，单位为纳克（ng）：检测取样量，单位为微升(μL)；纯化样品总量，单位为微升（μL)；纯化后样品DNA总量，单位为纳克（ng）。（2）
*（3)
用回收率样品的纯化前初始添加量（mpre）和纯化后样品的DNA含量（mpoa）绘制回收率曲线，获5
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得回收率曲线方程：
式中：
m pest
mpre=(mpos—a2)/b2,R2
纯化前初始添加量，单位为纳克（ng）：纯化后样品DNA总量，单位为纳克（ng）：常数：
常数；
相关系数。
（4）
6.7将供试品纯化后样品的DNA含量（ng）代人回收率曲线方程，求得供试品纯化前DNA残留量(ng);
最后通过供试品纯化前DNA残留量（ng），得到供试品单位重量的DNA残留量。M=m/m2
式中：
M..供试品单位重量DNA残留量，单位为纳克每毫克（ng/mg）；Tmi
供试品纯化前DNA残留量，单位为纳克（ng）；供试品干重量，单位为毫克（mg）。7结果判定
7.1标准曲线方程的相关系数R，2应大于0.99。7.2回收率曲线方程的相关系数R，°应大于0.95；最低回收率应不低于50%。7.3以供试品单位重量（mg）的DNA含量为最终的DNA残留量，报告实际检测数值。.....(5)
7.4如果最小稀释倍数条件下的荧光测定值低于最低检测限1.25ng/mL的荧光值时应为限量测定，表示为小于1.25ng/mL。
7.5以蛋白酶K消化、磁珠法DNA纯化、PicoGreen荧光染色三步法为例的试验方法中回收率试验最低样本量为6.25ngDNA，低于6.25ng时回收率明显下降，不能满足良好的准确性和精密度。因此，本试验方法中适宜的样本量为≥6.25ngDNA/样品，即：最低检测限为6.25ngDNA/样品。若样品中DNA残留量低于6.25ngDNA/样品时，应加大样品的取样量，同时相应地扩大蛋白酶K消化时的反应体积；如果在最大取样量的条件下仍不能满足上述条件，则只能报告未经回收率校正的检测值作为参考资料，此种情况在最终报告中应注明。注1：选用不同的DNA纯化方法时应预先进行最低检测限和最低回收率验证。注2：应充分考患本标准中方法的适用性和灵敏度。如果被检样品的残留DNA量很低，DNA纯化后的含量低于本方法的检出限时，应考虑使用其他方法（如实时定量PCR法）。注3：在实施本标准推荐的试验前，应考虑GB/T16886.1--2011或管理部门所推荐的方法（文件）所提示的信息，同时参考国内外研究的最新进展。[]
参考文献
YY/T0606.25—2014
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品GA/T383—2002法庭科学DNA实验室检验规范饶春明，等.应用荧光法测定重组细胞因子中残余DNA含量.药物分析杂志，2005，25（12）：[4]
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[9] Thomas W, et al.Quantification of DNA in biologic scaffold material. Journal of SurgicalResearch 2009,152:135-139.
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打印H期：2014年11月10日F009A中华人民共和国医药
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