【SN商检标准】 棉花皱叶病毒分子检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3287—2012
棉花皱叶病毒分子检疫鉴定方法Molecular detection and identification of cotton leaf crumple virus2012-10-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-05-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标推由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3297—2012
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国渐江出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。
本标推主要起草人：张永江、张明哲、李明福、冯黎霞、李桂芬。1范围
棉花皱叶病毒分子检疫鉴定方法SN/T3287—2012
本标准规定了棉花皱叶病毒（参见附录A）核酸的提取，PCR及实时荧光PCR检测的方法。本标准适用于进出境植物检疫中棉花皱叶病毒的检疫鉴定。2方法原理
棉花皱叶病毒学名：Cottonleafnrumplevirus，缩写：CLCrV，该病毒的分子生物学特征是本标准制定的主要依据。
3仪器设备、用具及试剂
3.1仪器设备
PCR仪、电泳系统、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、振蓄器、4C冰箱、电子分析天平（O.001g）、超净工作台、水浴锅、一80℃超低温冰箱、高压夹菌锅、制冰机、微波炉，3.2用具
可调移液器（2.5μL，10μL，20μL，100μL，000μL）及灭菌的吸头、离心管，PCR管和研体等。3.3试剂
除有特殊说明外，所有实验月试剂均为分析纯或生化试剂。实时荧光PCR试剂、三氯甲烷、异戊醇、乙醇、TagDNA聚合酶、DNA分子标记、溴化乙锭、琼脂糖等。
试剂配制见附录B。
4检疫鉴定方法
4.1常规PCR检测
提取样品DNA，设置阳性对照、阴性对照和空白对照，进行常规PCR扩增，具体操作步骤见附录。
4.2实时荧光PCR检测
提取样品DNA，设置阳性对照、阴性对照和空白对照，进行实时荧光PCR扩增。具体操作步骤见附录D。
5结果判断
样品经PCR及实时荧光PCR检测为阴性时判定样品不携带CLCrV。SN/T 32872012
样品经PCR检测为阳性，再经实时荧光PCR检测确认为阳性时，可判定样品携带（I.CrV。样品保存与记录结果
样品保存
检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在4～-80低温冰箱中，并作好登记和标记以备复核用。
结果记录
包括样品来源、种类,取样人员，检测原始记录、照片等文档存档，以便必要时复核。2
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A.1分类地位
附录A
（资料性附录）
棉花皱叶病毒背费资料
该病毒属子双生病毒科（Gcminiviritlac)菜互.金色花叶病毒属（Begomouirus）A.2寄主范围
SN/T 3287—2012
包括棉属（Gossypium），苟属（Ahutiton）、蜀葵属（Althaeu）木槿属（Hibtscus）、锦属（Maln）栗豆树属（Castanospermum）、大豆属（Glycine）、菜豆属（Phaseotts）及巢菜属（Vicia）的一些植物。A,3地理分布
该病毒主要分布在印度.墨酉,美国、危地马拉及中东地区。A.4传播途径
烟粉甄(Bemista tehaci)传播。A. 5 病害症状
该病毒侵染棉花造戒叶中脉组织增生、叶脉坏死或脉明，叶脉组织的叶肉部分偶尔出现红色小点，有时形成分散的泡斑；苞叶和花常畸形；叶柄弯曲，叶片向下卷曲并有明显的花叶（参见图A.「）。A.6病霉粒体特性
病毒粒体双生，无包膜，直径为17nm~~20mm,-聚体长30nm~32nm。A.7基因组特性
该病毒具有Bcgomovirus病毒典型的基因组，含有2条大小均为2.5kb3.0kb的单链闭合环状DNA分子.即DNA-A和DNA-B；两者是棉花皱叶系统感染必需的。A和B共同区（comineririgon，CR)的序列同源性相对较低，
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SN/T3287-2012
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图A.1棉花皱叶病毒侵染棉花叶片症状(弓自http://cals.arizona.edu/PLP/plpext/diseases/agronomic/eotton/cotlerumple.htm)KAoNiKAca
附录B
（规范性附录）
试剂配制
B.1十六烷基三甲基澳化胺（CTAB)DNA提取缓冲液十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）乙二胺四乙酸二钠（EDTA0.5mo/氯化钠（NaCI）
1mol/LTris-HCl
2-ME（β-巯基乙醇）
加水定容至200mL，调pH至8.0，121C高压天菌30mmB.2十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）沉淀液十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）氯化钠（NaCD）
加水定容至100mL，121℃高压爽B.3高盐TE缓冲液
乙二胺四乙酸二钠（EDTA05mo
氯化钠(NaCD
1mol/LTris-HCl
加水定容至100mL，调pH至8.
B.4电泳缓冲液TBE(5×）
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
硼酸HBO）
乙二胺四乙酸二钠（EDTA）
加双蒸水定容至500mL
用时加蒸馏水稀释至0.5XTAE
B.5溴化乙锭（EB）溶液（10μg/μL）溴化乙锭
灭菌去离子水
高压灭菌30m送
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SN/T 3287—2012
C.1 引物
附录C
（规范性附录）
常规PCR检测
正向引物prAV1154:5*-CT(G/C)AA(C/T)TTC(A/C)AAGT(C/T)TGGACG-3反向物prAV2644：5ATTACCGGATGUCCGC3扩增片段长度约110cbp，
注：引]自文献[17。
C. 2 DNA 提取
取待测样品0.5 g丁液氮中磨碎,加人 1.5 ml, 65 ℃预热的 2 ME/CTAB DNA抽提液,混勾后转入2mL离心管巾，于65℃温浴」h，不时混：用等体积的氯中烷/异戊醇（24：1)抽提，室温小10 000 r/min离心J0 min;四收上清液，加人等体积的 CTAB沉淀液,颠倒混勺,于 65 ℃温浴 1 h:10 000 r/min离心5 min,移出上清液,用1.5mL.高盐TE缓冲液重悬沉淀,加 2倍体积无水乙醇沉淀核酸；12000r/min离心15min，70%乙醇洗涤37℃-下燥后溶于100μL双蒸水中，一20%保存备用。注；或者按服商品INA提取试剂盒进行操作。C. 3PCR 扩增
PCR反应体系;见表 . 1,每个样品设2 个平行处理。反应体系中各试剂的量可根帮具体情说或不同的反应总体积迹行适当调整。检测时以含(I.CrV的植物材料的IDNA或含有 CLCrV 日标片段的质粒作为附性对照，以健康植物材料或菜豆金色花叶病毒属其它病毒的DNA作为阴性对照，以水代替INA模板作为空白对照。
PCR反应条件：945min;94℃30s，56℃455,72℃1min，30个话环；72℃10min延伸。表 C. 1 PCR 反应体系
PCR缓冲液;含 MgCl,）
上游引物
下游引物
Taq酶
储存被浓度
10 μmol/1.
20pal/L
20I01/L
5 U/ μL
加样量/l.
2. 3 mmol/L
0. 5 pμmol/L
0. 6 μmol/L
o. 15 U/μl.
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C.4琼脂糖凝胶电泳检测
SN/T 3287-2012
用 (0. 5XTBE配制 1%琼脂糖凝胶,加热溶化后冷却至 55 ℃左右。将凝胶倒入凝胶槽中,插 1:样品梳子。冷却凝固后投掉梳子，在电泳槽内加入.5×TI3F，缓冲液要没过凝胶表面约1rmml。将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔,同时设计PCR的阴性对照和阳性对照，并加人相对分子质量标准物(Marker)。接通电源，以3V/cl~-5V/em电场强度进行电泳,.5 h 后观察结果.电泳结束后,将凝胶放人 0,5 μg/tnL的溴化乙锭(FB)染色液巾染色 10 min~15 min1。将整个凝胶置于凝胶成像系统「观察，记录结果。C.5结果判定
如果阳性对照出现约1100hp的条带,检测样品.阴性对照和空白对照术出现条带，可判定样品为CLCrV阴性。
如果阳性对照及检测样品出现约1100bp的条带，阴性对照和空白对照术出现条带，可判定样品为 CLCrV 阳性。
结果可通过实时荧光PCR方法进一步确认。SN/T3287—2012
D.1引物和探针设计
附录DbZxz.net
（规范性附录）
实时荧光PCR检测
根据GenBank中公布的CLCrVCP基因的保守序列，设计引物和探针如下：引物序列：CLCrV-F.5-GCACGGCTATGGACTTTGGT8CLCrV-R:5*-CATGACCTGGAACCTATCTCTGAGA-3探针序列：CLCrV-P：5*-FAM
MTTTGACAATGAGCCCAGTACTGCCACTG-TAMRA-3D.2DNA提取
操作方法见C.2。
D.3实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表D.1.每个样品及对照设2个平行处理。检测时以含CLCrV的植物材料的DNA或含有CLCrV目标片段的质粒作为阳性对照：以健康植物材料或菜豆金色花叶病毒属其NA模板作为空白对照
他病毒的DNA作为阴性对照：以水代替D表D.1
PCR缓冲液
CLCrV-F
CLCrV-R
CLCrV-P
DNA模板
匙备液浓度
25mmol/L
10mmol/L
10mol/L
10μmol/L
10μmol/L
实时荧光PCR反应体系
终浓度
2.5mmol/L
0.25mmo1/1
o4amot
0.4umol/L
0.15μmol/1
加样量/uL
注：PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整，也可采用商业化的一步或两步法试剂盒。D.4实时荧光PCR反应
反应条件：95℃8min95℃10s5820s，68℃205，共40个循环点击运行，进行PCR反应，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出ARn（荧光信号增加值）与循环数之间关系的图像。8
D.5结果判定
SN/T 3287—2012
在阳性对照Ct值小于30,水空白对照Ct值等于40的条件下（若不满足该两项条件-此次检测效，应重做荧光PCR扩增）
待测样品的Ct值为10时，则判定未检测到CLCrV；待测样品的Ct值小于或等于35时,则判定检测到CLCrV目标；待测样品的Ct值小于40而大于35时，应重新逛行测试-如果重新测试的Ct值为410时，则判定未检测到CICrV标，如果重新测试的Ct值小于40而大于35时.则判定检测到CLCrV目标。
SN/T 3287—2012
考文献
[1] ldris, A. M. , and Brown. J. K. 1998. Sinaloa lornato leaf curl gcminivirus: Biological andmolecular evidence for a new subgroup II virus, Phytopathology 88,548-557.10
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