【SN商检标准】 国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4859—2017 国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定方法 Identification of Mycobacterium tuberculosis complex at frontier port 发布日期：2017-07-21 实施日期：2018-03-01 国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：陆哗、王健、章琪、方筠、孟成艳、叶魏、查期、贾哲甫、张晓航、韩晓辉、周娴、邱瑾。 引言 近年来，结核病实验室诊断新技术不断涌现，实现了快速而准确检测结核分枝杆菌及其耐药性的目标。目前我国依据《WS 288—2008 肺结核诊断标准》进行结核病诊断，其中结核病的实验室诊断仍主要依赖于痰标本涂片显微镜检查、传统的固体培养。显微镜检查敏感度较低，并且无法区分活性和非活性生物体，无法鉴别分枝杆菌类型。传统的固体培养基上，结核杆菌生长需要长达八周的时间，报告时间长。在无法及时确诊的情况下，适当的治疗被延迟。同时，实验室还需要快速而价廉的培养物鉴定方法用以区分结核分枝杆菌复合菌群和非结核分枝杆菌。WHO在结核病诊断方面的相关标准持续改进：将新的技术与方法恰当地纳入诊断方案，这也是有效采用新的诊断方法的先决条件之一。本标准在充分评估的基础上，规范了结核分枝杆菌实验室鉴定技术的应用路径及综合判断方案。通过新技术的采用，提高了国境口岸肺结核病的防控效率。 1 范围 本标准规定了国境口岸结核分枝杆菌复合群鉴定的生物安全要求、鉴定程序、鉴定方法、结果报告等内容。 本标准适用于国境口岸入出境人员感染结核分枝杆菌复合群的检测鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 结核病实验室生物安全手册 世界卫生组织人间传染的病原微生物名录 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 结核分枝杆菌复合群 Mycobacterium tuberculosis complex (MTC) 传染性结核病的病原菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌。MTC的细菌呈杆状，菌体大小0.6μm×(1μm～4μm)，抗酸染色阳性，革兰氏染色阳性。生长缓慢，约10h繁殖一代，据接种量的多少，10d～30d肉眼可见菌落生长。罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上的菌落粗糙、致密，呈颗粒、结节或菜花样，乳白或米色，不透明。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)：聚丙烯酰胺凝胶电泳 TBE (Tris-Boric acid)：Tris-硼酸核酸电泳缓冲液 bp (base pair)：碱基对 5 生物安全措施 根据WHO《结核病实验室生物安全手册》与GB 19489和《人间传染的病原微生物名录》的要求，结核分枝杆菌复合群相关检测鉴定材料的生物安全要求如下：样本处理与检测应于生物安全二级（BSL-2）实验室，在II级或以上级别生物安全柜内进行；大量活菌操作，如培养物鉴定、药敏检测等，应在生物安全三级（BSL-3）实验室或结核病防护实验室内的生物安全柜中进行。结核病防护实验室，是指在生物安全二级实验室基础上，实验区域与实验室外部由缓冲区域物理隔离，实验区域控制为单向气流；MTC的细菌培养物运输包装分类为A类，UN编号为UN2814；操作人员佩戴医用N95口罩，穿着一次性防护服，戴一次性医用橡胶手套，更换防水工作鞋；操作人员需要每年进行胸部X光检查、血清HIV检查。 6 仪器和设备 6.1 II级生物安全柜 6.2 电子天平 6.3 水平冷冻离心机（离心力3500g以上） 6.4 37℃恒温培养箱 6.5 荧光PCR仪 6.6 水平电泳仪 6.7 紫外成像仪 6.8 100℃热浴仪 6.9 正置光学显微镜 6.10 微量加样器（2μL、20μL、200μL、1000μL） 7 试剂和耗材 7.1 PCR反应体系（商品化试剂） 7.2 0.067mol/L pH 6.8磷酸缓冲液（PBS） 7.3 N-乙酰-L-半胱氨酸（N