【SN商检标准】 菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4404—2015 菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法 Screening protocol for Begomovirus by PCR 2015-12-04 发布 2016-07-01 实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、云南省烟草农业科学研究院、沈阳大学、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。 本标准主要起草人：沈建国、于文涛、李敏、方敦煌、杨彩霞、林春滢、蔡伟、张江、高芳銮、吴祖建。 1 范围 本标准规定了菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法。本标准适用于寄主植物中菜豆金色花叶病毒属病毒的检测鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 2122《进出境植物及植物产品检疫抽样》 3 菜豆金色花叶病毒属基本信息 中文名称：菜豆金色花叶病毒属 英文名称：Begomovirus 分类地位：双生病毒科（Geminiviridae） 其他信息参见附录A。 4 方法原理 Begomovirus病毒的分子生物学特性是制定本检测方法的主要依据。根据Begomovirus病毒鉴定方法的DNA保守区域设计特异性引物，建立该属病毒的分子生物学筛查方法。 5 主要仪器设备 高速冷冻离心机、PCR仪、凝胶成像分析系统。 6 检测与鉴定 6.1 抽样 抽样方法按照SN/T 2122中规定执行。 6.2 PCR检测方法 按照附录B给出的方法，进行PCR检测。 6.3 序列测定与分析 将PCR产物回收后，进行克隆、测序，测定的核苷酸序列与已知Begomovirus病毒序列进行比对。如果与已知的Begomovirus病毒序列同源性大于89%，则判定为Begomovirus病毒；同源性小于89%，则初步判定为Begomovirus属病毒的新种。若需进一步鉴定到具体病毒种类，应结合病毒生物学特性。 注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为 http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。 7 结果判定 7.1 采用PCR方法检测，如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常，待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定为未检出。 7.2 采用PCR方法检测，如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，且测定的序列为Begomovirus病毒，则判定为检出。 8 结果记录 记录样品信息和检测数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果以及实验人员签字。PCR检测方法应保存电泳照片，测序结果保存测序报告图。 9 样品保存 检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记，以备复核用。保存期满后，需经灭活处理。 附录A（资料性附录） Begomovirus病毒基本信息 A.1 分类地位 双生病毒科（Geminiviridae）。该病毒属所在的双生病毒科的组成结构见表A.1。 表A.1 双生病毒科的组成结构 | 属 (Genus) | 代表种 (Type species) | | :--- | :--- | | Mastrevirus | 玉米线条病毒 (Maize streak virus) | | Curtovirus | 甜菜曲顶病毒 (Beet curly top virus) | | Begomovirus | 菜豆金色花叶病毒 (Bean golden yellow mosaic virus) | | Topocuvirus | 番茄伪曲顶病毒 (Tomato pseudo-curly top virus) | A.2 寄主范围 寄主广泛，主要侵染双子叶植物，包括烟草、番茄、辣椒、棉花、甜瓜、木瓜、南瓜、西瓜、豇豆、巴豆、利马豆、大翼豆、绿豆、菜豆、蒿麻、木薯、番香蓟等。 A.3 分布地区 该属病毒主要分布于热带、亚热带及温带地区。 A.4 传播途径 自然传播介体为烟粉虱 (Bemisia tabaci)，以持久性方式传播。远距离传播主要通过带毒苗木传播。 A.5 病毒粒体形态 双联体结构，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。 A.6 病毒的基因组结构 多数Begomovirus包含2个单链环状DNA (ssDNA) 组分，长度相似，每条为2.5kb～2.6kb。少数...