【SN商检标准】 菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法

SN
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4404—2015
菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法ScreeningprotocolforBegomovirusbyPCR2015-12-04发布
有
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4404—2015
本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、云南省烟草农业科学研究院、沈阳大学、中国检验检疫科学研究院、福建农林大学。本标准主要起草人：沈建国、于文涛、李敏、方敦煌、杨彩霞、林春滢、蔡伟、张永江、高芳銮、吴祖建、1范围
菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法本标准规定了菜豆金色花叶病毒属病毒PCR筛查方法。本标准适用于寄主植物中菜豆金色花叶病毒属病毒的检测鉴定。2规范性引用文件
SN/T4404—2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽3菜豆金色花叶病毒属基本信息
中文名称：菜豆金色花叶病毒属英文名称：Begomovirus
分类地位：双生病毒科（Gemintuiridae）其他信息参见附录A。
4方法原理
Begomovirus病毒的分子生物学特性是制定本检节法的主要依据。根据Begomovirus病毒疫鉴定方
的DNA保守区域设计特异性引物，建立该属病毒的分子生物学筛查方法。主要仪器设备
5
高速冷冻离心机、PCR仪、凝胶成像分析系约检测与鉴定
6
6.1抽样
抽样方法按照SN/T2122中规定执行。6.2PCR检测方法
按照附录B给出的方法，进行PCR检测。6.3序列测定与分析
将PCR产物回收后，进行克隆、测序，测定的核苷酸序列与已知Begomovirus病毒序列进行比对如果与已知的Begomouirus病毒序列同源性大于89%，则判定为Begomovirus病毒；同源性小于89%1
SN/T4404—2015
则初步判定为Begomovirus属病毒的新种，若需进一步鉴定到具体病毒种类，应结合病毒生物学特性注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。结果判定
7.1采用PCR方法检测，如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常，待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定为未检出。7.2采用PCR方法检测，如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，且测定的序列为Begomovirus病毒，则判定为检出。8结果记录
记录样品信息和检测数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果以及实验人员签字。PCR检测方法应保存电泳照片，测序结果保存测序报告图。9样品保存
检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在一80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记，以备复核用保存期满后，需经灭活处理。
2
A.1分类地位
附录A
（资料性附录）
Begomovirus病毒基本信息
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双生病毒科（Geminiviridae）。该病毒属所在的双生病毒科的组成结构见表A.1。表A.1
双生病毒科的组成结构
属（Genus）
玉米线条病毒
Mastrevirus
曲顶病毒
双生病毒科
A.2
寄主范围
Curtovirus
伪曲项病毒
Topocuvirus
菜豆金色花叶病毒
Begomovirus
代表种（Typespecies）
玉米线条病毒
Maizestreakvirus
甜菜曲顶病毒
Beet curlytop virus
番茄伪曲顶病毒
Tomato pseudo-curly top virus菜豆金色花叶病毒
Beangoldenyellowmosaicvirus
寄主广泛，主要侵染双子叶植物，包括烟草、番茄、辣椒、棉花、甜瓜、木瓜、南瓜、西瓜、豇豆、巴豆、利马豆、大翼豆、绿豆、菜豆、蒿麻、木薯、番香蓟等。A.3
分布地区
该属病毒主要分布于热带、亚热带及温带地区。4传播途径
A.4
自然传播介体为烟粉虱（Bemisiatabaci)，以持久性方式传播。远距离传播主要通过带毒苗木传播。A.5
病毒粒体形态
双联体结构，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。6病毒的基因组结构
A.6
人多数Begomovirus包含2个单链环状DNA（ssDNA）组分，长度相似，每条为2.5kb～2.6kb。少数病毒为单个组分，已发现单组分病毒常常含有环状卫星ssDNA(DNA-β)。3
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B.1主要试剂
附录B
（规范性附录）
PCR检测方法
B.1.1CTAB提取缓冲液：20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCL,20mmol/LEDTA(pH8.0)。
2CTAB/NaCl：称取10gCTAB、4.1gNaCI，用ddHO溶解并定容至100mL。B.1.2
B.1.3氯仿。
B.1.4异丙醇。
B.1.5
B.1.6
B.1.7
异戊醇。
无水乙醇。
引物序列：
Begomo-F：5'-CCKGTGYGTGHRAATCCBegomo-R：5'-CCRARCWTYCAGSGSAGCT-3PCR扩增片段大小约900bp
B.2检测
B.2.11
DNA提取
称取病叶100mg（加15%PVP），液氮充分研磨）立即加
uL（65℃预热）2%CTAB抽提液，750
再加入16uL2-巯基乙醇。CTAB抽提液稍溶化后，用研棒将CTAB抽提液与磨碎的样品混匀，转人1.5mL离心管。65℃水浴加热
lh，每
的氯仿/异戊醇抽提，轻摇混匀
4
10min
20min摇动
管。加人等体积（约750μL)24：1次离心
心20min。回收
℃13
000r/min
水相，将上清（约750μL）小心地转离
人另一1.5mL离心管。加人1X10体积（约75750μL），氯仿/异戊醇二次抽提，4℃13000
转入另一1.5mL离心管。加人1/10体积LD65℃
预热的
nin离心
20min
TAB/NaCl，混匀。加人等体积（约回收水相，将上清（约750uL）小心地约75uL）3molLNaAC，混匀。加入等体积（约750uL）一20℃预冷的异丙醇。一20℃放置1h。4℃13000r/min离心15min。弃上清，沉淀用75%乙醇（预冷）洗涤2次，每次12000r/min离心2min，干燥后溶解于30μL50μLddHz0中，一20℃保存。注：DNA提取也可采用商业化的试剂盒。B.2.2PCR扩增
PCR反应体系见表B.1，每个反应设置2个重复。检测时以含有病毒目标片段的质粒或病毒材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照。PCR反应条件：94℃预变性5min，然后94℃变性1min、50℃退火1min、72℃延伸1.5min，35个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸10min。4
试剂名称
DNA
TaqDNA聚合酶（5U/μL)
dNTPs(10 mmol/L)
PCR缓冲液（Mg2+Free）
25mmol/LMgClz
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10μmol/L）
ddH2o
总体积
表B.1PCR反应体系
加样量/μL
1.0~3.0
0.125
0.5
5.0
2.0
1.0此内容来自标准下载网
1.0
.375~14.375
25.0
SN/T4404—2015
注：PCR反应体系中各种试剂的量可根据具休情况进行适当调整，也可采用商业化的试剂盒。B.2.3
琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳，电泳结束后染色，手再在凝胶成像系统中观察是否
扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍照并做记录。B.2.4
结果判断
如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定为阳性。
如果阳性对照、阴性对照和空自对照正常，待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定为阴性。
B.2.5
序列测定
PCR产物纯化、回收后，进行克隆测序。将测序所得到的核苷酸序列与已知的Begomouirus病毒相应序列进行比对。

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