【SN商检标准】 短颈剑线虫检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4171—2015
短颈剑线虫检疫鉴定方法
Detection and identification of Xiphinema brevicollum Lordello & DaCosta2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局，SN/T4171—2015
本标准主要起草人：迟远丽、廖力、王岚、徐森锋、权永兵、黄永辉、张卫东、陈其文I
1范围
短颈剑线虫检疫鉴定方法
本标准规定了出人境植物检疫中短颈剑线虫的检疫鉴定方法。SN/T4171—2015
本标准适用于出人境植物、花卉、苗木、盆景及其繁殖材料、土壤及栽培介质中短颈剑线虫的检疫鉴定。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T28091一2011剑线虫属（传毒种类）检疫鉴定方法SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T1158进出境植物盆景检疫规程SN/T2757
3符号和缩略语
植物线虫检测规范
下列符号和缩略语适用于本文件。n：测计的标本数；
a：体长/最大体宽；
b：体长/体前端至食道与肠连接处的距离；c：体长/尾长；
c：尾长/肛门处体宽；
h：尾后部的透明区长；
L：体长；
Lipw：头部宽度；
Odontophone：齿尖针延伸部长度；Odontostyle：齿尖针长度；
Tail：尾长；
V：体前端至阴门的距离×100/体长；VBW：阴门处的体宽；
BWGR：导环处体宽；
BWOB：食道基部体宽；
GR：导环至体前端的距离；
Spicules：交合刺的长度
基本信息
中文名称：短颈剑线虫。
SN/T4171—2015
学名：XiphinemabrevicollumLordello&.DaCosta,196l。异名：X.saopaoloenseKhan&.Ahmad,1975,X.americanumApudCarvalho,1955,1962,X.diffusumLamberti&Bleve-Zacheo,1979(n.syn.),X.paruumLamberti,Ciancio,Agostinelli&.Coiro,1992(n.syn.),X.pseudoguirani Lamberti,Ciancio,Agostinelli&.Coiro,1992(n.syn.),Xguirani ApudLamberti&.Bleve-Zacheo,1979,X.SheriLamberti &.Bleve-Zacheo,1979(n.syn.),X.tayloriLamberti,Ciancio,Agostinelli&.Coiro,1992(n.syn.)。分类地位：线虫门（Nematoda），无侧尾腺纲（Adenophorea），矛线目Dorylaimida），矛线亚目（Dorylaimina），矛线总科（Dorylaimoidea），长针科（Longidoridae），剑亚科（Xiphinematinae），剑属（Xiphinema），美洲剑线虫组（Xiphinemaamericanum-group）。短颈剑线虫是一种非常重要的植物寄生线虫，主要危害寄主植物的根部，引起根部组织变黑，皮层增厚，侧根增生，长势变弱，造成根系肿大或坏死。短颈剑线虫主要通过带根苗木、土壤及栽培介质传播扩散，雌、雄虫形态学特征是该虫检验鉴定的主要依据，寄主范围、地理分布等信息可供参考（参见附录A）。5方法原理
根据形态特征描述和形态特征测计值采用Hunt(1993)的长针科分类系统进行线虫的分类鉴定。6
仪器、用具和试剂
6.1仪器
生物显微镜、体视显微镜（具透射光源）、恒温培养箱、冰箱、离心机6.2用具
钟面皿或培养血、盖玻片、载玻片、挑针、酒精灯、线虫滤纸或纱布、500uL塑料管、漏斗、漏斗架、乳胶管、止水夹、加热板、水桶、分样筛（60目～300目）、移液器、干燥器、记号笔。6.3试剂
4%甲醛、甘油、指甲油、石蜡、溶液I（96%乙醇：甘油：蒸馏水=20：1：79）、溶液Ⅱ（甘油：96%乙醇=1：19)。
7现场检疫
对植物种苗的根、茎根、根状茎等地下部分材料进行检查，观察苗木的生长状况，根部为害状，以及是否带介质、土壤等。重点选取根部组织变黑，皮层增厚，侧根增生，长势变弱，根系肿大或坏死等症状的苗木及根际介质或土壤，如无可疑症状则按要求随机取样。取样后立即置密封塑料袋，标记后及时送实验室检验，
具体抽样比例按SN/T1157和SN/T1158执行。8实验室检验
线虫分离
8.1.1土壤或介质中线虫的分离
线虫的分离采用改进的过筛法：将约500g土样置于水桶中，捏碎土块并加水搅拌均匀，形成土壤2
SN/T4171—2015
悬浮液，静置约30s后将上清液通过60目的分离筛，将悬浮液注人新的水桶中，再静置约30s，再将土壤悬浮液经过300目的分样筛，收集筛上的残留物，然后结合漏斗法或浅盘法进行分离（具体操作按照SN/T2757)。
8.1.2植物组织中线虫的分离
将植物材料（茎干、根、叶柄等)切成小段，大小约2cm，用漏斗法或浅盘法进行分离（具体操作按照SN/T2757)。
8.2体视显微镜镜检
分离获得的水样在体视显微镜
8.3生物显微镜观察、摄影和测量验查，初步观察线虫的形态结构，挑取或吸取疑似短颈剑线虫。将线虫置于载玻片上制成临时玻片或永久玻片，在生物显微镜下仔细观察其形态特征并对整体形态、齿尖针、尾部形态、雌虫生殖系统及雄虫交合刺等进行摄影，并测量相应的测计值。9形态鉴定特征
9.1美洲剑线虫组的主要鉴别特征雌虫虫体热杀死后呈“C”形或螺旋形：唇区圆，与身体连接处平展或有不同程度缢缩；矛线型食道，齿尖针强壮，60μm～200μm；双生殖管，子宫中无z\分化现象，卵巢反折；V值为42%~65%；尾短，雄虫少见，有5枚或超过5枚中腹交配乳突，最后一c<2.5，宽圆或圆锥形，有的种略显有有一指状突。
枚一般位于交合刺所在区域，其他特征与雌虫相似。美洲剑线虫组线虫的分类检索表参见附录B。9.2短颈剑线虫形态特征（参见附录C)9.2.1
成熟雌虫形态特征
短颈剑线虫成熟雌虫主要形态特征如下，1800μm~2200μm；
热杀死后虫体呈“C”形或者螺旋形，体长为12.25μm~14.75μm；
唇区与虫体连接处略缩，唇区基部宽约为齿针和导环结构典型，齿尖针全长为136μm~168um，齿尖针长84.7μm~108.2μm，齿针延伸部分长为48μm~60μm；
食道基部膨大，与肠分界明显，食道球呈圆柱状；阴门横裂，位于虫体体长的50%左右。阴道长占所在位置体宽的1/3；双生殖腺，对生，均发育完全，卵巢转折覆盖输卵管；尾短锥形，透明区呈轻微指状凸起，尾长为肛门处体宽的0.661.11倍。9.2.2成熟雄虫形态特征
短颈剑线虫成熟雄虫主要形态特征如下：热杀死后虫体呈螺旋形，体长为1965uμm～2191um，体前部与雌虫相似；齿尖针和导环结构典型，后导环距体前端距离为102.25μm；泄殖腔前一共有5个腹中交配乳突；交合刺矛线型，长约为41μm~55uμm；尾呈短锥形，比雌虫的长，约是肛门处体宽的1.12倍，尾部透明区也呈轻微指状凸起。3
SN/T4171—2015
幼虫形态特征
短颈剑线虫幼虫主要形态特征如下：除生殖系统均未发育完全，其他特征与成虫相似；虫体热杀死后呈“C”型，随龄期增长身体弯曲程度加大；唇区微缩；
尾锥形，随着龄期增长尾长基本不变，尾宽增加；尾尖圆，有轻微指状凸起。
短颈剑线虫测计值
短颈剑线虫测计值见表1。
形态指标
Odontostyle/μm
Odontophone/μm
GR/μm
Tail/μm
LipW/μm
BWGR/μm
BWOB/μm
VBW/μm
Spicules
短颈剑线虫测计值
测量值
17早 Lamberti et al.(1991)
2100±100(1800~2200)
44.5±23(40.7~50.1)
6.4±0.6(5.4~7.7)
77.8±0.6(60.394.0)
1.0±0.06(0.9~1.1)
53.0±0.9(51.0~54.0)
101.9±7.2(84.7~108.2)
57.0±2.9(48.8~60.0)
86.3±5.6(72.3~92.3)
26.8±2.0(24.1~31.2)
8.0±0.9(5.9~9.4)
11.5±0.5(10.612.3)
29.8±1.5(27.1~31.8)
39.4±2.9(35.3~45.3)
46.6±3.4(39.4~50.0)
4 Shesh Kumari (2010)
2059±97(1965~2191)
45.7±3.81(41.3~49.1)
6.1±0.53(5.7~6.7)
80.2±6.29(72.8~82.0)
1.03±0.10(0.93~1.14)
93±4.86(88~99)
55±3.10(51~58)
30±2.22(27~32)
8±2.22（5~10)
13±0.50(12~13)
31±0.82(30~32)
48±6.22(41~55)
注：以上早早引自Lamberti etal.(1991)，引自SheshKumari(2010)，—表示空白
短颈剑线虫与近似种的区别
在剑属线虫中，短颈剑线虫（X.brevicollum）与X.incognitum、X.paramonoui形态上极为相似，其主要区别见表2。
形态特征
头部特征
尾部特征
短颈剑线虫与近似种的主要形态区别X.brevicollum
唇区与身体连接处微缢缩
短锥形，尾尖透明区呈轻微指状突起1800μm~2200μm
24μm~31μm
结果判断
X.incognitum
唇区半圆形，微缢缩
锥形，尾端角质层厚，背凸起，无指状突1700μm~2100μm
27μm~31μm
SN/T4171—2015
X.paramonovi
唇区与体壁不连续，缢缩
尾末端圆
2000μm~2300μm
>32μm
主要依据雌、雄虫的形态特征作为该虫的鉴定依据，符合第9章形态鉴定特征及测计值的线虫可判定为短颈剑线虫，其寄主和地理分布（参见附录A)等信息可供参考11
样品保存
若鉴定为短颈剑线虫，则将剩余的线虫杀死、固定制成永久玻片保存；也可以用4%甲醛固定后长期保存。标签上应注明样品编号、种名、寄主、产地、制作人和制作时间等。对已鉴定出带有短颈剑线虫的植物材料，要保存在5℃10℃及防鼠防虫处，并标明样品编号、截获日期、截获人、寄主名称、运输工具名称、输出国名等，样品需至少保存6个月，以备复验、谈判和仲裁。SN/T4171—2015
短颈剑线虫的寄主
附录A
（资料性附录）
短颈剑线虫的寄主和分布
大叶相思（Acaciaauriculaeformis）、羊蹄甲（Bauhiniablakeana）、秋枫（Bischofiajavanica）、柑橘（Citrusreticulata）、咖啡（Coffeaarabica）、龙眼（Dimorcarrpuslongan）、红背桂（Ercoecariacochinchinensis）、草莓（Fragariaananassa）番茄（Lycopersiconesculentum）、灰木莲（Magnoliaceaeglanca）、悬钩子（Rubusspp.）、鸡蛋花（Plumeriarubra）、石楠（Photiniaserrulata）、樱桃（Prunuspseudocerasus）、梨（Pyrusspp.）葡萄(Vitisspp.）等A.2
短颈剑线虫的分布
欧洲：俄罗斯、西班牙、保加利亚、意大利、匈牙利、波兰、斯洛伐克、罗马尼亚；非洲：毛里求斯、南非、肯尼亚、马拉维：美洲：美国、巴西、委内瑞拉、秘鲁、洪都拉斯：亚洲：乌兹别克斯坦、以色列。S
（资料性附录）免费标准下载网bzxz
美洲剑线虫组多歧检索表
美洲剑线虫组多歧检索表见表B.1。表B.1
Xiphinema
X.bacaniboia
X.himalayense
X.inaequale
X.laevistriatum
X.neoamericanumsp.ing.
X.silvaticum
X.americanum sensustricto
X.brevicollum
X.brevisicum
X.bricolense
X.californicum
X.citricolum
X.diffusum
X.duriense
X.floridae
X.fortuitum
X.georgianum
X.incertum
X.incognitum
X.intermedium
X.kosaigudense
X.lambertii
X.longistillum
X.madeirense
X.mesostilum
美洲剑线虫组多歧检索表（引GB/T28091—2011）A
SN/T4171—2015
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