【SN商检标准】 国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4273—2015
国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法Real time PCR detection methods of Banna virus at ports2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4273—2015
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院，本标准主要起草人：洪烨、丁国允、孙薇、周艳容、师永霞、郑夔、黄吉城、刘扬、戴俊、苏水宽、贺骥、孙肖红、幸芦琴、李小波、钟玉清、相大鹏、郭波旋。I
1范围
国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法SN/T4273—2015
本标准规定了国境口岸版纳病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，包括标本采集、处理，检验程序、方法及结果判定。
本标准适用于国境口岸版纳病毒的实验室检测。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的值时所经历的循环数RNA：核糖核酸
FAM:FAM荧光染料，一-种荧光报告基团3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
版纳病毒Bannavirus
版纳病毒（Bannavirus，BAV)为12节段双链RNA病毒，是一种虫媒病毒，主要经蚊虫传播，可引起人类发热和病毒性脑炎，目前该病毒主要分布在我国和印度尼西亚等地区。版纳病毒电镜下观察为二十面体球形颗粒，表面有纤突，直径在60nm～70nm之间。病毒的基因组由12个节段的双链（dsRNA)组成，全长约为21000bp。
实时荧光PCRreal-timefluorescencePCR实时荧光PCR方法是在常规PCR的基础上，加人一套可反映PCR扩增过程的荧光报告系统，通过监测系统接收到荧光信号，实时判断每个反应管内目的基因的模板扩增情况。4主要仪器设备
本方法使用的主要仪器包括荧光定量PCR仪、超净工作台、Ⅱ级生物安全柜、高压灭菌锅、低温高速离心机（最大离心力20000×g）、玻璃研磨器、漩涡振荡器、冰箱（4℃、一20℃、一70℃或液氮罐）、移液器等。
SN/T4273—2015
5主要试剂
本方法使用的主要试剂包括核酸提取试剂如Qiagen公司的QIAampViralRNAKitl\、实时荧光RT-PCR通用试剂如Ambion公司的Ag-Path-IDTMOnestepRT-PCRKit'、PBS溶液（pH7.O）、无RNA酶的DEPC水、引物和探针（针对版纳病毒Vp12基因片段编码区核苷酸高度保守区进行设计，引物和探针序列见表1等。
表1版纳病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针引物/探针名称
Banna-FP
Banna-RP
Banna-probe
标本的采集与处理
6.1人体标本
序列（5-3°）
CGTAATTTTATGGACCACCTGGA
CATAAGAAGCATGGCGACCTAG
FAM-CTACTGGTCCTGTGCO
CGTTAGGTCCCBHQ1
无菌采集发热期可疑病人的静脉血或脑扩增片段大小
mL，血标本于室温静置30min使其凝固，500×g离心10min，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，脑脊液则直接装人2mL无菌螺口塑低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，将血清或脑脊料管，用耐低温油性记号笔记上编号，液置于一70℃保存。
6.2蚊标本
将采集的蚊子直接放入一20
30min以上冻死后，取出，分类编号，一般按30～50只一份，C冰箱
不足30只的可按采样点或分类归为装
螺口塑料血清管内，旋紧管盖，做好编号。于2mL
一70℃以下运输或保存。蚊标本处理时应在冰上操作从
70℃容器中取出蚊标本，倒人研磨器中，加入PBS液1mL，反复研磨至组织碎片基本消失，随即将研磨液吸）1.5mL离心管配平后置预冷
4℃的离心机上，12000r/min离心1min。取上清液提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，剩余的蚊标本研磨液需保存在一70℃以下容器以备复查7病毒核酸提取方法
按试剂盒说明提取核酸，用于实时荧光RT-PCR检测。或一70℃储存RNA待检。8
实时荧光RT-PCR检测
反应体系配制
配制20μL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：无RNA酶的灭菌双蒸水2.2uL、2×RT-1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
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PCR缓冲液10μL、20μmol/LBanna-FP0.5μl、20μmol/LBanna-RP0.5μL、5μmol/LBanna-Probe1μL、25×RT-PCREnzymeMix0.8μL、模板RNA5μl。如使用其他试剂，应根据其他试剂的要求作相应调整。
8.2扩增程序
在不同的荧光定量PCR仪上，TaqMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。在ABIStepOnePlus荧光定量PCR仪上检测时，扩增程序为：50℃10min，95℃10min；95℃5s→60℃20s（检测荧光信号），45循环。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。8.3结果分析
阐值确定
一般是以荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阅值，以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阀值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值）。8.3.2质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线；
阳性对照Ct值<35并有明显扩增曲线。8.3.3结果判定
8.3.3.1根据以下条件进行结果判定：一一无明显扩增曲线，判断为版纳病毒实时荧光RT-PCR检测阴性；-两管待检标本反应体系中有一管或两管有明显扩增曲线，且Ct值≤40，判断为版纳病毒实时荧光RT-PCR检测阳性；
有明显扩增曲线，且40小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。