【SN商检标准】 国境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4161-2015
国境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR方法
Detection methodfor vibrio parahaemolyticusbyreal-timefluorescencePCRatfrontierports
2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江西出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡婷、杨春华、刘岚、孙思扬、谢玉萍、徐菱菱、周延。SN/T4161—2015
1范围
国境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR方法
SN/T4161—2015
本标准规定了国境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR检验的对象、标本的采集、运输和保存，操作方法及结果报告。
本标准适用于国境口岸副溶血性弧菌感染的筛选检测。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.17—2003食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验GB/T4789.20一2003食品卫生微生物学检验水产食品检验GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193
WS/T230
术语和定义
基因检验实验室技术要求
临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用下列术语和定义适用于本文件。3.1
副溶血性弧菌
vibrioparahaemolyticus
副溶血性弧菌，属弧菌科弧菌属，革兰染色阴性，兼性厌氧菌，为多形态杆菌或稍弯曲弧菌。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、发烧、腹泻及水样便（重症者为黏液便或黏血便)为主要症状。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）PCR：聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）TagDNApolymerase：TaqDNA聚合酶5
检测对象
疑似副溶血弧菌感染者的临床标本，如粪便疑似副溶血弧菌污染环境标本，如水样，以及食品。1
SN/T4161—2015
6实验室生物安全和PCR防污染要求实验室生物安全应符合GB19489的规定。PCR防污染措施按WS/T230和SN/T1193的规定执行。
7仪器与器材
实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管。生物安全柜。
高速冷冻离心机：最大转速1
台式离心机（离心速度900g）
涡旋振荡器。
恒温水浴锅。
高压灭菌锅。
低温冰箱、冷藏、冷冻冰箱。
可调式微量加样器。
8试剂
生理盐水：蒸馏水和NaCI配制浓度为0.8.1
阳性对照品：人工制备含副溶血弧菌检测序列的质8.3
阴性对照品：灭菌双蒸水ddH2O。8.4
EDTA-Na2的混合液
DNA提取液：含0.9%NaCI
1和01%
检测程序
样品的采集
粪便样本
采集病人发病早期新鲜粪便于
5g8g，水样便采集1mL~3mL。
一次性无菌采便
管内，成形便采集
经旋转，有可见粪便的棉拭放人采便管内。采亦可用湿润的直肠棉拭插人直肠内3cm~5cm处并轻轻便管外表贴上带有唯一标识号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。9.1.2水样标本
水样用无菌容器采集3mL～5mL，密闭后外表贴上带有唯一识别标识号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。
食品标本
肉与肉制品的取样方法按GB/T4789.17一2003中的规定。9.1.3.2
各种水产食品及其制品的取样方法按GB/T4789.20一2003中5.1的规定。9.2样本的运转与保存
样本运输采用冰壶加冰密封运输。对于不立即检测的样本，应保存于一20℃待检2
样本的前处理
粪便样本
SN/T4161—2015
挑取米粒大小粪便，放置于有0.5mL生理盐水的离心管中，振荡混匀，16200g离心2min。去尽上清，沉淀用于核酸提取。
水样样本
取标本3mL，16200g离心2min。去尽上清，沉淀用于核酸提取。9.3.3
食品样本
以无菌方法取肉类或水产品组织样品0.1g，用0.2mL无菌生理盐水离心管中研磨，然后100℃沸水中加热5min8000g离心3min，上清用于以后的荧光PCR反应9.4样本的DNA提取
在标本的前处理沉淀中，加人100μLDNA提取液充分混勾，沸水浴10min。16200g离心5min，上清可直接用于荧光PCR反应。也可以使用商品化的DNA提取试剂盒并按照说明书操作。9.5实时荧光PCR检测
9.5.1待检测所需各种试剂充分融化后，请先将各试剂剂盒进行实时荧光PCR检测时，应根据9.5.2
开行离
30s然后开始实验。应用其他等效试情况进行适当的体系优化后再进行检测。实时荧光PCR引物、探针序
学列，见表1。
表1副溶血性弧菌核酸实时荧光PCR引物、探针序列
引物名称
上游引物
下游引物
上游引物免费标准bzxz.net
下游引物
上游引物
下游引物
上游引物
下游引物
5~-3+)
核酸序列(5
CAAGGTTTTGAGGTG
AATCCTTCAACATO
FAM-CAAGCCTGACTCAAGCGATT-1
TGAAGGTTTGACTGCCGTTGT
TGGGTTTTCGACCAAGAACTCA
FAM-TTCTCACCCATCGCCGATTCAACCGC-BHQ1TACAACAATCAAAACTGAATC
CATCTTTGTWAGGTTTTCTTTT
FAM-CGGTTTGTCCAATAGTCCTCCAC-BHQ1GCTGAGAAGTTTGTGTTC
CGAAGATAAGGTTTCAACTC
FAM-CAACAACAGCAACTCACCGC-BHQI长度（bp）
种特异性基因
毒力基因
SN/T4161—2015
荧光PCR反应体系配置按表2中的顺序，依次加入。表2副溶血性弧菌核酸实时荧光PCR检测反应体系名称
2XPCRBuffer
上游引物（12.5μmol/L）
下游引物（12.5μmol/L）
探针（5μmol/L）
Nuclease-Free Water
总体系
TaKaRaPremixExTaqTM试剂盒中组分。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的唯一认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。9.5.4：设立阴性对照和阳性对照9.5.5荧光PCR反应：将加好样的PCR反应管分别转移到荧光定量PCR检测仪上进行扩增反应。荧光通道检测选择：FAM通道。荧光PCR扩增程序按照表3中的程序进行设置，反应总体积为25μL。9.5.6首先进行种特异性基因检测，若检测为阳性，则继续进行毒力基因检测；若种特异性基因检测为阴性，则无需进行毒力基因检测。副溶血性弧菌核酸实时荧光PCR的反应程序表3
扩增及荧光收集
结果判定及报告
反应温度
是否采集荧光信号
循环数
阴性对照Ct值应显示0，阳性对照Ct值≤36并有典型的扩增曲线，否则此次检测结果无效，需重做。
当同时进行的阳性对照以及阴性实验结果正常，本方法检验结果判定如下：检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤36时，判为阳性；检测样品荧光增幅曲线的Ct值介于36和40之间时，建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性。此类样本建议用其他方法进一步验证；否则判为阴性；检测样品无荧光增幅现象，判为阴性。本方法报告模式如下：
SN/T4161—2015
若种特异性基因toxR/gyrB两者之一结果为阳性，且毒力基因trh/tdh两者之一结果为阳性即报告副溶血性弧菌核酸阳性且含毒力基因；若种特异性基因toxR/gyrB两者之一结果为阳性，且毒力基因检测为阴性则报告为副溶血性弧菌核酸阳性，但不含毒力基因；一若种特异性基因toxR/gyrB检测均为阴性，则报告为副溶血性弧菌阴性
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