【SN商检标准】 水仙退化病毒检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4179—2015 水仙退化病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Narcissus degeneration virus 发布日期：2015-02-09 实施日期：2015-09-01 发布机构：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：林石明、沈建国、廖富荣、方志鹏、吴媛、陈青、陈红运、黄蓬英。 1 范围 本标准规定了水仙退化病毒血清学、分子生物学检疫鉴定方法。本标准适用于石蒜科等寄主植物中水仙退化病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 水仙退化病毒基本信息 中文名称：水仙退化病毒 学名：Narcissus degeneration virus 缩写：NDV 属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员。 传播途径：种球传播、机械传播。NDV的其他信息参见附录A。 4 方法原理 水仙退化病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。 5 仪器设备及用具 电子天平（1/1000g）、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析系统、pH计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL）、PCR反应管、无RNaseEppendorf离心管（1.5mL）、研钵、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、低温冰箱和超低温冰箱等。 6 检测与鉴定 6.1 抽样检查 按照 SN/T 2122 给出的方法进行抽样、取样。 6.2 捕获抗原酶联免疫吸附测试（PTA-ELISA） 按附录 B 给出的方法进行 PTA-ELISA 检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。 6.3 RT-PCR 检测 按附录 C 给出的方法进行 RT-PCR 检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。 6.4 序列测定与分析 将 PCR 产物回收后，进行克隆、测序，或者 PCR 产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列（或翻译后的氨基酸序列）与已知的 NDV 相应序列进行比对。注：序列比对可利用 NCBI 网站上的 BLAST 软件进行，网址为 http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。 7 结果判定 当 PTA-ELISA 和 RT-PCR 检测结果均为阳性时，则判定为检出水仙退化病毒（NDV）。 当 RT-PCR 检测结果为阳性、测定的序列为 NDV 序列时，则判定为检出水仙退化病毒（NDV）。 注：根据国际病毒分类委员会（ICTV）第 9 次分类报告中马铃薯Y病毒科病毒种类的分类标准，其中关于基因组序列的判定依据为：CP 氨基酸序列一致性小于 80%，或者 CP 基因或整个基因组的核苷酸序列一致性小于 76%；并且聚合蛋白的剪切位点不相同。 8 结果记录 记录样品信息及各项检测数据，包括样品来源、种类，检测时间、地点、方法和结果等，以及检测人员签字。血清学检测结果保留吸光值的数据，分子生物学检测结果保留电泳照片及测序峰图等。 9 样品保存 阳性的样品应妥善保存在低温或超低温冰箱中，并做好登记和标识，以备复核。 附录A（资料性附录） 水仙退化病毒基本信息 A.1 寄主范围 石蒜科（Amaryllidaceae）的中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）、红口水仙（N. poeticus）、喇水仙（N. pseudonarcissus）和石蒜（Lycoris radiata）等。 A.2 病害症状 在水仙上表现为叶片褪绿条纹、斑驳，花杂色、畸形，以及植株矮化等症状。 A.3 分布地区 主要分布于英国、新西兰、中国等国家。 A.4 传播途径 鳞茎种球等繁殖材料是远距离扩散的主要途径；自然条件下机械传播。 A.5 病毒形态 病毒粒体为线条状，长 750nm～770nm。