【SN商检标准】 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第2部分：貂成分检测 PCR-试纸条法

ICS67.050
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5145.2—2019
出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第2部分：貂成分检测
PCR-试纸条法
Rapid Identification of animal ingredient in export food and feedPart 2:Detection of Martes IngredientPCR-Lateral flow dipstick method2019-10-25发布
中华人民共和国海关总署发布
2020-05-01实施
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SN/T 5145.2—2019
SN/T5145%出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法》分为以下13个部分：第1部分：猫成分检测PCR-试纸条法；第2部分：貂成分检测
PCR-试纸条法；
第3部分：鹿成分检测
PCR-试纸条法；
第4部分：骆驼成分检测
PCR-试纸条法；
第5部分：狗成分检测
第6部分：牛成分检测
PCR-试纸条法；
PCR试纸条法；
第7部分：绵羊成分检测
第8部分：驴成分检测
PCR-试纸条法：
PCR-试纸条法；
第9部分：狐狸成分检测PCR-试纸条法：第10部分，鹅成分检测
第11部分：鸣成分检测
PCR-试纸条法；
PCR-试纸条法；
第12部分：火鸡成分检测
第13部分：鸽子成分检测
PCR-试纸条法；
PCR-试纸条法；
本部分是SN/T5145的第2部分。
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津海关、天津师范大学、中国检验检疫科学研究院、北京华大蛋白质研发中心有限公司。
本部分主要起草人：郑文杰、张宏伟、刘培、赵良娟、李宗梦、张霞、刘伟、陈颖、尹长城、孙金生。1
1范围
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SN/T 5145.2—2019
出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第2部分：貂成分检测PCR-试纸条法本部分规定了食品及饲料中貂源性成分检测的PCR-试纸条方法本部分适用于肉、肉制品及饲料中貂源性成分的定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样
GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语
术语和定义
下列术语和定义适应于本文件。3.1.1
貂Martes
属于哺乳纲，食肉目，鼬科。本标准中貂成分即指貂特异性DNA片段3.2缩略语
下列缩路语适用于木文件。
DNA：deoxyribonuleicacid，脱氧核糖核酸dNTP：deoxyribonuleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸CTAB：cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵Tris：Tris(Hydroxymethyl):minomethane，三羟甲基氨基甲烷。EDTAEthylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸。FITC：Fluorescein5-isothiocyanate，异硫氰酸盐。4方法原理
利用裂解液破碎样本细胞，苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，以提取的DNA为模板，采用上游和下游弓物分别经异硫氰酸盐（Fluorescein5-isothiocyanate，FITC）和生物素（Brotin）标记进行PCR扩增，获得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的PCR产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的免多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对PCR产物进行筛选检测，并对PCR阳性产物进行测序确证。SN/T5145.2—2019
5试剂和材料
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除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。5.1貂源性成分检测用引物（对)序列及标记物为：貂成分扩增引物详见表1。
表1试验用引物
物种名称
5.2试剂
引物序列（6°→3)
F:5\-GCCCCATGCATATAAGCATGTACAT-3R:5’CCCATTTGAAGGGTTAGTAGGR\5.2.1ExTagHotStartDNA聚合酶(Taq,Termusauaticu)5'端标记物
异硫氰酸盐(FITC)
生物素（hiotin）
靶基因
D-Icop
5.2.2dNTPs：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺三磷酸）dTTP(deoxythymidinetriphosphate脱氧胸苷三磷酸）、dCTP（deoxyadenosinecytidinetriphosphate，脱氧胞苷昔三磷酸），dGTP（deoxyguannosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）。5.2.310XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/LKCl,20mmol/LMgCl2a5.2.4三氯甲烷（氯仿）。
5.2.5异丙醇。
5.2.6CTAB提取液.20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNaEDTA,pH8.0。
5.2.7CTAB沉淀液：5g/LCTAB,40mmol/LNaCl-pII8.0。酚/三氯甲烷/异戊醇溶液：按照Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为25：24：1进行5.2.8
配制。
三氯甲烷/异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为24：1进行配制。70%Z醇（V/V)。
NaCI溶液(1.2nol/L)
蛋白酶K（2cmg/mL）。
5.2.13试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条，可通过采购的原料试剂自行组装（参见附录A)或采用等效的商品化试纸条。5.2.14展开液：10mmol/LTris，1%BSA1%（v/v)Tween20以及浓度为0.05mol/L的NaOH：或采用等效的商品化产品。
6仪器设备
离心机（离心力≥12000g），4℃士1℃。6.2
微量移液器（100m-1000，20-200，2200.5㎡-10）。6.3PCR仪。
恒温水浴锅，65℃1℃。
天平：感量0.01g。
6.6pH计。
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核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7
7检验步骤
7.1样品制备
7.1.1食品
SN/T 5145.2—2019
将固状待检样品研磨混勾，分装三份，其中一份为检样，另外两份为留存样品。液状样品直接分装，加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式尽量去除样品中的盐、糖和色素等杂质。7.1.2饲料
饲料样品按照GB/T11699.1采样，或若粒度为20日称取200mg，60目称取100mg.100称取100mg
样品DNA提取
称取100mg样品于2mL离心管中，加人1mLCTAB提取液，加入10μL20mg/mL蛋白酶K，65温育1h，期间不时震荡混匀，应保证样品白由悬浮丁液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液：取出后12000g离心10min，转移上清至2ml.离心管中，加入等体积的室温酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1)颠倒混勾，120c0g转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24：1），颠倒混匀，室温下12000g离心10min；转移上清至干净离心管中，加人等体积的CTAB沉淀液混勾，室温沉淀1h；加人0.8倍体积的异内醇或2倍体积一20℃冰箱中预冷的无水乙醇混匀，一20℃放置30min，12000g4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12c00g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加入50uL双蒸水，室温10min，混匀，一20保存。L述方法可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA，7.3DNA浓度和纯度的测定
取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1)计算：C-AXNX50/1000
式中：
C——DNA浓度，单位为微克每微升（g/uL）)；A——260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
当A260/A280比值在1.7-1.9之间时，适宜于PCR扩增7.4PCR扩增
7.4.1PCR反应体系
见表2。
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表2PCR反应体系
10×PCR缓冲液（含20mMMg+）
正向引物（5μmol/L）
反向引物（5μmol/L）
Ex Taq Ilot Start(5 U/μL)
DNA模板（4ng/μL)
dNTP(2.5 mM each)
灭菌ddH.O
7.4.2反应条件
94℃预变性5min;94℃变性30sec55℃退火30sec72℃延伸30sec，30个循环后进入72℃5min。PCR反应条件随不同的PCR仪略有改变。检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含貂源性成分的样品作阳性对照，用已知不含貂源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。7.4.3试纸条检测
取5μLPCR产物点于核酸试纸条样品垫，加入到95uL展开液中进行检测，5min后观察结果。8质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a）空白对照：质控线变红，检测线未变红。b)
阴性对照：质控线变红，检测线未变红。阳性对照：质控线变红，检测线变红。结果判断与报告
结果判定
试纸条质控线变红色，且检测线变红色，PCR扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物经测序进行确证(序列参见附录B)。
试纸条质控线变红色，检测线不变色，PCR扩增产物为阴性。9.2结果报告
PCR产物试纸条检测为可疑阳性，同时测序结果与NCBI基因库同源性达到97%及以上者，判为含有貂源成分，结果报告为检出貂源成分：PCR产物试纸条检测为可疑阳性，测序结果与NCBI基因库同源性低丁97%者，视比对结果具体分析，判定是否含有貂源成分；PCR产物试纸条检测为阴性，判为不含有貂源成分，结果报告为未检出貂源成分。4
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检测过程中防止交叉污染的措施10
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检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。11
废弃物处理
检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中楚烧处理。12
检出限
本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为0.1%（质量分数）。5
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附录A
（资料性附录）
含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条A.1组成成分
A.1.1抗FTC抗体单克隆抗体或多克隆抗体：单克降抗体：Anti-FITCantibody鼠单克降抗体多克隆抗体：Anti-Fluorescein免多克隆抗体2质控线上的二抗：依据上述免多抗或鼠单抗方案可分别选择羊抗免或者羊抗鼠抗体A.1.2
3链亲和素：重组链亲和素，大肠杆菌表达的重组Streptavidin蛋白。A.1.3
试纸条结构
吸水滤纸垫：
结合物垫，附有FITC抗体（免源）与胶体金颗粒的交联体：侧向层析基质（硝酸纤维素膜）：检测带，附有链亲和素：
质控带，附有可结合免源抗体的抗体：衬底：
吸水垫。
A.3试纸条检测原理
检测用试纸条的吸水垫L含有金标记的抗异硫氰酸盐（FITC）的免多克降抗体，可与PCR产物条链上的FAM标记分子结合，在检测线位置上固定有链亲和素，可与PCR产物另一条链上的生物素结合。
阳性PCR扩增产物在展开液的作用下，首先与金标记的羧基荧光素抗体结合，通过虹吸作用向上部移动，在经过固定有链亲和系的检测线位置时，因带有生物系标记面被链亲和素捕获在该位置上，显示棕红色，过量的产物继续向上移动至固定有羊抗免抗体的质控线位置，因其带有抗异硫氰酸盐的免多克隆抗体而被捕获在质控线上，从而显示出两条色带。非特异性抗增的PC尺产物因无生物素或异硫氰酸盐标记的缘故，不能与金标记的异硫氰酸盐抗体结合，且被链亲和素捕获，从而不能在检测线位置显示颜色.而未参与反应的PCR引物因带有异硫氰酸盐标记，故也可被异硫氰酸盐抗体捕获向上一直移动至质控线被羊抗免抗体捕获而显色。6
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行业B
（标中出行业）
PCR口华和食验疫
SN/T5145.2—2019
国人出民共入品及境检饲准料动食物（gennbank源：Nc_012141.1）CCATATCAGCTCAACATACAATACTCTATTAATACCCTATGTACATCGTGCATTAAATTGTTCACCCCATGAATAATAAGCATGTACATAATATTATTTATCTTACATGAGTACATCATATTATTGATCGTACATACCCCATCCAAGTCAAATCATTTCCAGCCAACACGCATATCACCACCCATATTCCACGAGCTTAATCACCAAGCCGCGGGAAATCAGCAATCCCTCCAATTACGTGTCCCAATCCTCGCTCCGGGCCCATCTAAACGTGGGGGTTTCTACGG
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