【SN商检标准】 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第7部分：绵羊成分检测 PCR-试纸条法

ICS67.050
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5145.7—2019
出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法
第7部分：绵羊成分检测
PCR-试纸条法
Rapid Identification of animal ingredientin exportfood and feedPart 7:Detection of Ovis aries Ingredient PCR-Lateral flow dipstick method2019-10-25发布
中华人民共和国海关总署发布
2020-05-01实施
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SN/T 5145.7—2019
SN/T5145%出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法》分为以下13个部分：第1部分：猫成分检测PCR-试纸条法；第2部分：貂成分检测
PCR-试纸条法；
第3部分：鹿成分检测
PCR-试纸条法；
第4部分：骆驼成分检测
PCR-试纸条法：
第5部分：狗成分检测
第6部分：牛成分检测
PCR-试纸条法；
PCR试纸条法；
第7部分：绵羊成分检测
第8部分：驴成分检测
PCR-试纸条法：
PCR-试纸条法；
第9部分：狐狸成分检测PCR-试纸条法：；第10部分鹅成分检测
第11部分：鸣成分检测
PCR-试纸条法；
PCR-试纸条法；
第12部分：火鸡成分检测
PCR-试纸条法；
第13部分：鸽子成分检测
PCR-试纸条法；
本部分是SN/T5145的第7部分
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津海关，天津师范大学，中华人民共和国西宁海美，北京华大蛋白质研发中心有限公司，天津科技大学。本部分主要起草人：郑文杰、李宗梦、风晓博、刘国红、张霞、赵良娟、张宏伟、王硕、尹长城、孙金生。1
1范围
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出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法第7部分：绵羊成分检测PCR-试纸条法
本部分规定了食品及饲料中绵羊成分检测的PCR-试纸条方法本部分适用于肉、肉制品及饲料中绵羊成分的定性检测。2规范性引用文件
SN/T 5145.7—2019
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样
GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适应于本文件。3.1.1
Ovisaries
属于哺乳纲.偶蹄日，牛科，绵羊属。本标准中绵羊成分即指绵羊特异性DNA片段3.2缩略语
下列缩珞语适用于本文件
DNA：deoxyribonuleicacid，脱氧核糖核酸dNTP：deoxyribonuleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸。CTAB：cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵。Tris：Tris(Hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。EDTA：Ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸FITC.Fluorescein5-isothiocyanate，异硫氰酸盐。4方法原理
利用裂解液破碎样本细胞，苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，以提取的DNA为模板采用游和下游引物分别经异硫氰酸盐（Fluorescein5-isothiocyanate，FITC）和生物素（Biotin）标记边行PCR扩增，获得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的PCR产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的免多克隆抗1Www.bzxZ.net
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体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对PCR产物进行筛选检测，并对PCR阳性产物进行测序确证。
5试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂：实验用水符合GB/T6682的要求。5.1绵羊源性成分检测用引物（对)序列及标记物为：绵羊成分扩增引物详见表1。
表1试验用引物
物种名称
5.2试剂
引物序列（5-→3'）
F.5'-TCCATATATTGGCACAAACC-3
R,5'-GAGGATGAGGATTAGTAGGATAGCA-35.2.1ExTagHotStartDNA聚合酶(Taq,Termusauaticu)。5'端标记物
异硫氰酸盐（FITC)
生物素（bictin）
靶基因
5.2.2dNTPs：dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dTTP（deoxythyrnidinetriphosphate，脱氧胸昔三磷酸），dCTP（deoxyadenosinecytidinetriphosphate，脱氧胞三磷酸）、dGTP（deoxyguannosinetriphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）。5.2.310XPCR缓冲液：20cmmol/LTris-HCl(pH8.4).200mmol/LKCl.20mmol/LMgCl25.2.4三氯甲烷（氯仿）。
5.2.5异丙醇。
5.2.6CTAB提取液:20g/LCTAB,1.4mol/L.NaCl0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNazEDTA，pH8.0。
5.2.7CTAB沉淀液：5g/LCTAB,40mmol/LNaClpII8.0。5.2.8酚/三氯甲烷/异戊醇溶液：按照Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为25：24：1进行配制。
5.2.9三氯甲烷/异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为24：1进行配制。5.2.1070%Z醇(V/V)。
5.2.11NaCI溶液(1.2mol/L)。
蛋白酶K（20mg/mL）。
5.2.13试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条，通过采购的原料试剂自行组装（参见附录A)或采用等效的商品化试纸条。5.2.14展开液：10mmol/LTris，1%BSA，1%（v/v)Tween20以及浓度为0.05mol/L的NaOH：或采用等效的商品化产品。
6仪器设备
离心机（离心力≥12C00g）,4℃土1℃6.1
6.2微量移液器（100μ1000μL,20~-200μ,2μ~20μ.0.5μ10μL)。6.3PCR仪。
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恒温水浴锅，65℃±1℃。
6.5大平：感量0.01g。
6.6pH计。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计7检验步骤
7.1样品制备
7.1.1食品
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将固状待检样品研磨混匀，分装三份，其中一份为检样，另外两份为留存样品，液状样品直接分装加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方式尽量去除样品中的盐、糖和色素等杂质。7.1.2饲料
饲料样品按照GB/T14699.1采样，或若粒度为20目称取200mg，60目称取100mg，100目称取100mg
7.2样品DNA提取
称取100mg样品于2mL离心管中，加入1mLCTAB提取液，加人10μL20mg/mL蛋白酶K，65℃温育1h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量CTAB提取缓冲液；取出后120c0g离心10min，转移上清至2mL离心管中，加入等体积的室温酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1)颠倒混匀，12000g转速下离心10min转移上清至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24：1），颠倒混匀，室湿下12000g离心10min：转移上清至干净离心管中，加入等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h；加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积一20℃冰箱中预冷的无水乙醇混勾，一20℃放置30min，12000g4℃离心1cmin，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加入50μL双蒸水，室温10min，混勾，一20℃保存。上述方法可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。7.3DNA浓度和纯度的测定
取5I.DNA溶液加双蒸水稀释至1mL,使用核酸蛋分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1)计算：C=AXNX50/100C
式中：
C—DNA浓度，单位为微克每微升（g/μL)；A——260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
当A260/A280比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增，7.4PCR扩增
7.4.1PCR反应体系
见表2。
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表2PCR反应体系
10XPCR缓冲液（含20mMMga+）
正向引物（5μmol/L）
反向引物（5μmal/L）
Ex Taq Ilot Start (5 U/uL)
DNA模板（4ng/μL)
dNTP (2.5 mM each)
灭菌ddH.O
7.4.2反应条件
94℃预变性5min;94℃变性30sec,55℃退火30sec,72℃延伸39sec.30个循环后进入72℃5min。PCR反应条件随不同的PCR仪略有改变检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含绵羊源性成分的样品作阳性对照，用已知不含绵羊源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。7.4.3试纸条检测
取5pLPCR产物点于核酸试纸条样品垫，加入到95uL展开液中进行检测,5min后观察结果。8质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：a）空白对照：质控线变红，检测线未变红。阴性对照：质控线变红，检测线未变红。b)
阳性对照：质控线变红，检测线变红。结果判断与报告
结果判定
试纸条质控线变红色，且检测线变红色，PCR扩增产物为可疑阳性。可疑阳性产物经测序进行确证（序列参见附录B)。
试纸条质控线变红色，检测线不变色，PCR扩增产物为阴性。9.2结果报告
PCR产物试纸条检测为可疑阳性，同时测序结果与NCBI基因库同源性达到97%及以上者，判为含有绵羊源成分，结果报告为检出绵羊源成分；PCR产物试纸条检测为可疑阳性，测序结果与NCBI基因库同源性低97%者，视比对结果具体分析，判定是否含有绵羊源成分；PCR产物试纸条检测为阴性，判为不含有绵羊源成分，结果报告为未检出绵羊源成分。iiiKAa~cJouakAa
检测过程中防止交叉污染的措施10
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检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。废弃物处理
检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。检出限
本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为0.1%（质量分数）。5
SN/T5145.7—2019
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附录A
（资料性附录）
含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条A.1组成成分
A.1.1抗FITC抗体单克隆抗体或多克隆抗体：单克降抗体：Anti-FITCantibody鼠单克降抗体多克隆抗体：Anti-Fluorescein兔多克隆抗体A.1.2质控线上的二抗：依据上述兔多抗或鼠单抗方案可分别选择羊抗免或者羊抗鼠抗体3链亲和素：重组链亲和素，大肠杆菌表达的重组Streptavidin蛋白A.1.3
A,2试纸条结构
吸水滤纸垫；
结合物垫.附有FITC抗体（免源）与胶体金颗粒的交联体：侧向层析基质(硝酸纤维素膜）；检测带，附有链亲和素：
质控带.附有可结合免源抗体的抗体；衬底；
吸水垫。
A.3试纸条检测原理
检测用试纸条的吸水垫上含有金标记的抗异硫氰酸盐（FITC)的免多克隆抗体，可与PCR产物条链上的FAM标记分了结合，在检测线位置上固定有链亲和素，可与PCR产物另一条链上的生物素结合。
阳性PCR扩增产物在展开液的作用下，首先与金标记的羧基光素抗体结合，通过虹吸作用向上部移动，在经过固定有链亲和素的检测线位置时，因带有生物素标记而被链亲和素捕获在该位置上，显示棕红色，过量的产物继续向上移动至固定有羊抗免抗体的质控线位置，因其带有抗异硫氰酸盐的免多克隆抗体而被捕获在质控线上，从而显示出两条色带。非特异性扩增的PCR产物因无生物素或异硫氰酸盐标记的缘故，不能与金标记的异硫氰酸盐抗体结合，且被链亲和素捕获，从面不能在检测线位置显示颜色，而未参与反应的PCR引物因带有异硫氰酸盐标记，故也可被异硫氰酸盐抗体捕获向上一直移动至质控线被羊抗免抗体捕获而显色。6
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附录B
（资料性附录）
PCR产物测序结果
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绵羊源性成分的基因扩增靶标参考序列（gennbank号：AF010406.1）TCCATATATTGGCACAAACCTAGTCGAATGAATCTGGGGAGGATTCTCAGTAGACAAAGCTACCCTCACCCGATTTTTCGCCTTTCACTTTATTTTCCCATTCATCATCGCAGCCCTCGCCATAGTTCACCTACTCTTCCTCCACGAAACAGGATCCAACAACCCCACAGGAATTCCATCGGACACAGATAAAATTCCCTTCCACCCTTATTACACCATTAAAGACATCCTAGGTGCTATCCTACTAATCCTCATCCTC
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