【国家标准】 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定

中华人民共和国国家标准
GB5413.40—2016
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定2016-08-31发布
人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
2017-03-01实施
1范围
食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定本标准规定了液相色谱法测定游离核昔酸总量的方法GB5413.40—2016
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中游离核苷酸总量（包括胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌吟核苷酸、鸟嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸）的测定。2原理
试样经过水提取，用沉淀剂沉淀蛋白质后，通过高效液相色谱分离，用紫外检测器外标法测定试样中核苷酸的含量。
试剂与材料www.bzxz.net
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水，液相色谱流动相用水为GB/T6682规定的一级水。
3.1试剂
淀粉酶：酶活力≥1.5U/mg。
冰乙酸(CHCOOH)。
四丁基硫酸氢铵（CH）NHSO4。
甲醇(CH.OH)。
磷酸氢二钾（K,HPO4）。
磷酸二氢钾（KHPO）。
磷酸（H,PO）。
3.2试剂配制
乙酸溶液（100mL/L）：吸取10mL冰乙酸，加水定容到100mL。磷酸氢二钾溶液（0.1mol/L）：称取2.28g磷酸氢二钾，用超纯水溶解并定容到100mL3.2.3磷酸盐缓冲液（1.40mmol/L四丁基硫酸氢铵，0.01mol/L磷酸二氢钾）：称取1.360g磷酸二氢钾，加0.4753g四丁基硫酸氢铵，加900mL水溶解，用磷酸氢二钾溶液调pH至3.2.用水定容到1000mL。一周内使用。
核苷酸标准品
胞嘧啶核苷酸(CMP)(C,HN.OP)：纯度≥99%。3.3.1
腺嘌呤核苷酸（AMP)(C1cHuNO,P)：纯度≥99%。3.3.2
尿嘧啶核苷酸（UMP)(C,HisN.O,P)：纯度≥99%。1
3.3.4鸟嘌呤核苷酸（GMP)(ClHNO.P)：纯度≥99%。3.3.5次黄嘌呤核苷酸（IMP）（ClHlN,O，P）：纯度99%。3.4标准溶液配制
GB5413.40—2016
核苷酸标准混合液（应当天配置）：分别称取核苷酸标准品CMP、AMP、UMP各10mg、GMP和IMP各5mg（准确至0.1mg），用超纯水溶解转移至同一个100mL容量瓶中，用水定容至100mL。此标准溶液浓度为：CMP、AMP,UMP各100μg/mL：GMPIMP各50μg/mL。每个组分称取的质量都要校正水分和钠盐含量，以酸型计。4仪器与设备
高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器4.2天平：感量0.1mg。
pH计：精度0.01。
恒温培养箱：土2℃
5分析步骤
试样制备
5.1.1样品预处理
5.1.1.1含淀粉的试样
称取混合均匀的固体试样约5g（精确至0.1mg），于100mL锥形瓶中，加入约0.2g淀粉酶，加人20mL热水（30℃～40℃）充分溶解试样，或称取混合均匀的液体试样约20g（精确至1mg）于100mL锥形瓶中，加人约0.2g淀粉酶摇匀，于37℃土2℃培养箱内酶解30min。取出冷却至室温5.1.1.2不含淀粉的试样
称取混合均匀的固体试样约5g（精确至0.1mg），于100mL锥形瓶中，加人20mL热水（50℃~60℃）充分溶解试样，冷却至室温，或称取混合均匀的液体试样约20g（精确至1mg）于100mL锥形瓶中。5.1.2待测液的制备
用醋酸溶液调试样溶液pH4.1.移入50mL容量瓶中，定容，滤纸过滤，所得滤液用0.45um微膜过滤备用。
参考色谱条件
5.2.1流动相：磷酸盐缓冲液+甲醇=1000+40。5.2.2色谱柱：Cig-T反相色谱柱（250mm×4.6mm，5um）或具同等性能的色谱柱。5.2.3流速：1mL/min。
5.2.4波长：254nm。
5.2.5柱温：25℃。
5.2.6进样体积：10L
注：必要时可以用磷酸或磷酸氢二钾溶液适当调流动相的pH至分离情况最佳2
5.3标准曲线绘制
GB5413.402016
分别吸取标准混合溶液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL，加超纯水定容至50mL，配成核苷酸系列标准工作液，见表1。
核苷酸系列标准工作液各组分浓度AMP
单位为微克每毫升
将上核苷酸系列标准工作液分别注人高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高。以峰面积或峰高为纵坐标，以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线。5.4试样溶液的测定
将制备好的试样溶液注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积或峰高。根据标准曲线得到待测液中核苷酸的浓度(μg/mL)。
6分析结果的表述
6.1结果计算
试样中游离核苷酸各组分的含量X,(CMP、UMP、GMP、IMP、AMP)按式(1)计算：_c.×V.×n×100
m，×1000
式中：
（1）
试样中核苷酸各组分的含量（分别是：XcMP、XuMP、XGMP、XIMP、XAMp），单位为毫克每百克(mg/100g);
试样溶液中核苷酸各组分的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）；试样溶液的体积，单位为毫升（mL)；样液稀释倍数；
试样的质量，单位为克（g）。
试样中游离核昔酸的总量按式（2)计算：X=EX=XcMP+XAMP+XUMP+XGMP+XIMP式中：
试样中游离核苷酸的总量，单位为毫克每百克（mg/100g）；按式（1)计算出的游离胞嘧啶核苷酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；按式（1)计算出的游离腺嘌呤核苷酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；按式（1)计算出的游离尿嘧啶核苷酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；按式（1）计算出的游离鸟嘌呤核苷酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）；按式（1)计算出的游离次黄嘌岭核苷酸含量，单位为毫克每百克（mg/100g）。(2)
结果表示
GB 5413.40—2016
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留到小数点后两位。精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%其他
高效液相色谱紫外法标准和试样核苷酸色谱图见附录A。本标核苷酸各组分定量限分别为：CMP
定量限为
定量限为
定量限为
定量限为
定量限为
3.3mg/kg。
5.0mg/kg。
5.0mg/kg。
5.0mg/kg。
6.7mg/kg。
核苷酸标准品色谱图
附录A
核苷酸标准品和试样高效液相色谱图核苷酸标准品色谱图见图A.1。
样品色谱图
样品色谱图见图A.2。
.a. no
核苷酸标准品色谱图
样品色谱图
GB5413.402016
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