【行业标准】 恶性卡他热检疫技术规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2855—2011
恶性卡他热检疫技术规范
Quarantine protocol for malignant catarrhal fever2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T2855—2011
本标准修改采用国际动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2009版）中2.4.15章“恶性卡他热”部分。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：孙敏、梁成珠、孔繁德、郑小龙、高宏伟、邓明俊、林超、刘彩霞。1
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1范围
恶性卡他热检疫技术规范
SN/T2855—2011
本标准规定了恶性卡他热的临床诊断、病毒分离鉴定、间接荧光抗体试验、免疫过氧化物酶试验、病毒中和试验、竞争抑制酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应等检疫方法的技术要求本标准适用于进出口牛、鹿、猪等多种动物恶性卡他热的检疫和诊断。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件
MCF（malignantcatarrhalfever）：恶性卡他热。AIHV-1（alcelaphineherpesvirus-1）：猬羚疱疹病毒1型OvHV-2（ovineherpesvirus-2）：绵羊疱疹病毒2型PBS(phosphatebufferedsaline）：磷酸盐缓冲液CPE(cytopathiceffect）：细胞病变效应IgG(immunoglobulinG)：免疫球蛋白GTCIDs（50%tissuecultureinfectivedose）：半数组织培养感染量PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链反应DNA(deoxyribonucleicacid)：脱氧核糖核酸dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核糖核苷三磷酸dATP（deoxyadenosinetriphosphate）：脱氧腺苷三磷酸dCTP(deoxycytidinetriphosphate）：脱氧胞苷三磷酸dGTP（deoxyguanosinetriphosphate）：脱氧鸟苷三磷酸dTTP（deoxythymidinetriphosphate）：脱氧胸苷三磷酸bp(basepair）：碱基对
FITC（fluoresceinisothiocyanate）：异硫氰酸荧光素DMSO(dimethylsulfoxide)：二甲基亚TBE：Tris（三羟甲基氨基甲烷）、硼酸、EDTA（乙二胺四乙酸）缓冲液Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数4临床诊断
4.1临床表现
从最急性到慢性型病例，恶性卡他热（MCF)的临床症状相差甚远。最急性病例，既无临床症状，也TKANYKAa
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无精神沉郁，只在死前12h～24h可能出现腹泻和下痢。一般情况下，MCF病例症状是伴随着高热逐步出现的，起初眼异流液，继之转变为黏脓性分泌物，病备可能食欲下降，产奶量降低。特征性症状包括：
病畜双眼角膜从外周开始逐渐浑浊；有些病例可在会阴、乳房和乳头部，出现皮肤损害（主要表现为溃疡和渗出），并可形成硬痴（与上皮坏死有关）。口腔充血、流涎，并逐步发展为舌、硬和齿龈溃疡，颊乳头糜烂是其典型症状；浅表淋巴结肿大，四肢关节肿大；出现感觉过敏、运动失调、眼球震额等神经症状，在无其他症状时可能出现头颈部僵硬。其他资料参见附录A。
4.2病理学变化
4.2.1.解剖病理学变化包括：
胃肠道可能有出血和糜烂，急性病例可出现肠道内容物带血；淋巴结肿天，但程度不一。淋巴结切开时，常见发白、硬化，有些可见颌下淋巴结和咽后淋巴结出血甚至环死
一呼吸道可见卡他性炎症积液，糜烂和白喉膜生成；泌尿道膀胱上皮层淤血性出血，肾皮质出现白色小坏死灶，直径约1mm～5mm，有时可被出血带包围。
4.2.2组织病理学变化：确诊MCF的基础。淋巴器官上皮变性，血管炎症、增生乃至坏死，非淋巴器官间质广泛分布淋巴细胞是其特征性变化，如：所有上皮表面出现溃疡和糜烂，常伴发上皮和上皮内淋巴细胞浸润；一常见大脑血管炎，血管外膜和膜介质出现淋巴细胞浸润，并常见类纤维变性。血管腔内可见淋巴细胞贴壁，重病例可见内皮损伤和内皮下膜淋巴细胞集聚，有时可见血管堵塞；淋巴结增生以副皮质淋巴样干细胞膨胀为特征，常伴发滤泡退行性病变，淋巴组织炎性水肿常涉及周围组织；
一非淋巴组织特别是肾皮质和肝门静脉周围区的间质淋巴细胞集聚明显，脑内可能有非化脓性脑膜炎、脑脊髓炎，伴随淋巴细胞周围的套状白细胞聚集及脑脊髓液中细胞成分增多；角膜淋巴细胞浸润，从周边逐步向中心发展，随病程延长，发展为水肿和坏死。也可能出现脉管炎、眼前房积脓和虹膜睫状体炎。5实验室诊断
5.1猬羚疱疹病毒1型（AIHV-1型）5.1.1病毒分离
5.1.1.1设备和材料
生物安全柜、立式冷冻离心机、倒置光学显微镜、二氧化碳培养箱、高压灭菌锅、蔡氏滤器和微孔滤膜（0.22μum）、细胞瓶、细胞培养板、15mL离心管、组织研磨器、微量可调加样器及配套吸头（20μL和200μL）、移液管。
细胞：反动物源的大多数原代或低代细胞都可用于AIHV-1的病毒分离·常用牛甲状腺细胞。5.1.1.2试剂
DMEM培养基或其他培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素及其他常规试剂，配制方法见附录B。试2
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验用水应符合GB/T6682要求。
5.1.1.3操作方法
5.1.1.3.1样品采集和送检
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无菌采集动物抗凝全血（使用EDTA作抗凝剂）。对病死动物，立即采集淋巴结、肾上腺、脾、肺等组织，置于冰盒中冷藏保存，尽快送实验室进行处理。5.1.1.3.2样品处理
5.1.1.3.2.1抗凝全血的处理
取抗凝血加人2倍~3倍体积红细胞裂解液，混勾静置4min～5min，待红细胞完全破碎，1500g离心5min。弃上清液去除红细胞，得到白细胞沉淀（若仍有红细胞，则重复上述步骤）。加人PBS缓冲液，制成白细胞悬液，一20℃保存备用。5.1.1.3.2.2动物组织的处理
取病料组织5g，剪碎后置于无菌平血内，加人10mL无血清培养液（含青霉素2000IU/mL、链霉素2000μg/ml），用无菌研研磨，制备成组织悬液。300g离心10min，收取上清液一20℃保存备用。5.1.1.3.3病毒分离
将上述细胞悬液的浓度调整至5×10°个/mL，接种于制备好的单层细胞培养物上，置5%二氧化碳培养箱.37℃吸附60min。补充适量细胞维持液继续培养，36h～48h后换液一次，以后每2d～3d换液一次。培养过程中每日观察细胞病变（CPE）情况，连续观察21d。特征变化是：单细胞层内出现多核灶，并逐渐收缩形成带有胞质突的聚集体，聚集体最终脱离。如果不出现CPE，应盲传二次，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养。盲传两代，无CPE，则判为阴性。以不接种样品的细胞培养物作为阴性对照。
5.1.1.3.4分离物鉴定
使用特异性血清或单克隆抗体，采用免疫荧光或免疫细胞化学技术对分离物进行鉴定。5.1.2间接荧光抗体实验（IFA）5.1.2.1设备和材料
荧光显微镜、二氧化碳培养箱、电热恒温水浴箱、超低温冰箱、立式冷冻离心机、台式离心机、微量可调加样器及配套吸头（20μL和200μL）、多孔载玻片、盖玻片、1.5mL和15mL离心管。细胞：牛鼻甲细胞。
5.1.2.2试剂
DMEM培养基、胎牛血清、PBS、胰蛋白酶、EDTA、伊文思兰、兔抗牛荧光抗体、甘油配制方法见附录B。
5.1.2.3操作方法
5.1.2.3.1抗原片的制备
5.1.2.3.1.1用10%胎牛血清DMEM细胞生长液在细胞瓶中培养牛鼻甲细胞。3
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5.1.2.3.1.2待细胞长成单层后，弃去瓶中的细胞培养液，加入2%胎牛血清DMEM细胞维持液，接种AIHV-1病毒（WC11株），放人37℃二氧化碳培养箱培养2d～4d。在培养带毒细胞的同时，培养部分正常细胞。
5.1.2.3.1.3每天观察细胞病变，待细胞病变即将出现又未出现时，弃去培养基，用PBS洗1次，5.1.2.3.1.4在细胞瓶中加人5mL胰蛋白酶-EDTA细胞消化液消化细胞，待细胞完全变圆，倒掉消化液。
5.1.2.3.1.5用PBS将脱落的细胞用移液管移到15mL离心管中，800g离心5min，弃上清液。加入PBS洗涤细胞1次后,用PBS将细胞重悬。5.1.2.3.1.6用PBS调整细胞浓度，调至细胞悬液滴加至多孔载玻片上为单层，不重叠为最佳。5.1.2.3.1.7用200μL加样器滴加病变细胞于多孔载玻片上，同时设置正常细胞对照孔，风干。丙酮固定10min，干燥，一70℃保存备用5.1.2.3.2抗体检测
5.1.2.3.2.1用10%牛血清（PBS稀释）封闭抗原片，即用10%牛血清滴加所有细胞孔，包括正常细胞孔和感染细胞孔，滴加好的玻片马上放人湿盒内（盒内垫有湿纱布），37℃孵育30min。5.1.2.3.2.2取出玻片，用PBS洗3次，每次浸泡2min。5.1.2.3.2.3将玻片晾干，滴加1：20稀释的待检血清，每个样本滴加2个孔，即1孔正常细胞，1孔感染细胞.同时设阳性血清对照和阴性血清对照，滴加时应避免相互交叉串孔，置37℃湿盒内孵育30min。
5.1.2.3.2.4取出玻片，用PBS洗3次，每次浸泡5min，其间轻轻振摇数次。5.1.2.3.2.5取出玻片晾干，滴加稀释好的免抗牛FITC荧光结合物，置于37℃湿盒内孵育30min。5.1.2.3.2.6取出玻片，用PBS漂洗3次，每次浸泡5min，其间轻轻振摇数次。5.1.2.3.2.7用1/101伊文思兰复染30s,PBS洗涤2min。玻片用蒸馏水漂洗2次，再用PBS/甘油（50/50）封片，在荧光显微镜下观察结果。5.1.2.3.2.8结果判定：正常细胞孔细胞无荧光反应.滴加阳性血清的感染细胞孔细胞有荧光反应，滴加阴性血清的感染细胞孔细胞无荧光反应，即可判定结果。待检血清的感染细胞孔细胞无荧光反应判为阴性，感染细胞的细胞核、细胞浆有荧光反应者判为阳性。5.1.3免疫过氧化物酶试验（IPT）5.1.3.1设备和材料
光学显微镜、二氧化碳培养箱、电热恒温水浴箱、超低温冰箱、立式冷冻离心机、台式离心机、微量可调加样器及配套吸头（1mL和200μL）、莱顿试管、4格玻片、1.5mL和15mL离心管。细胞：牛鼻甲细胞。
5.1.3.2试剂
DMEM培养基、胎牛血清、PBS、胰蛋白酶、过氧化物酶标记的抗牛IgG、甘油、吐温-20、AEC底物（3-氨基-9-乙基咔唑）配制方法见附录B。5.1.3.3操作方法
5.1.3.3.1抗原片的制备
5.1.3.3.1.1在内置盖玻片的莱顿试管或4格玻片上，用10%胎牛血清DMEM细胞生长液培养牛鼻甲细胞。
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5.1.3.3.1.2待细胞长成单层后，弃去细胞培养液，将病毒稀释成10″TCID5o（病毒滴定同5.1.4.3.1.2），接种至莱顿试管，每管1.6mL，或接种至4格玻片内，每格1mL。同时设置正常细胞对照。
5.1.3.3.1.3观察细胞病变，当CPE出现时，丙酮固定10min，干燥，一70℃保存备用。5.1.3.3.2抗体检测
5.1.3.3.2.1用IPT稀释液将待检血清1：20稀释，在固定好的病毒感染盖片或玻片格上滴加稀释血清150uL～200L，滴加好的玻片置37℃湿盒内孵育30min。同时设置阴性血清和阳性血清对照，5.1.3.3.2.2取出玻片，用PBS洗3次，每次浸泡5min，其间轻轻振摇数次。5.1.3.3.2.3取出玻片晾干，在盖玻片或玻片格上滴加150μL～200μL过氧化物酶标记的抗牛IgG（用IPT稀释液1：5000稀释），置37℃湿盒内孵育30min5.1.3.3.2.4取出玻片，用PBS漂洗3次，每次浸泡5min，其间轻轻振摇数次。5.1.3.3.2.5用蒸馏水稀释AEC底物（蒸馏水5mL.缓冲液2滴，双氧水2滴，AEC3滴），并在盖玻片或玻片格上滴加150uL～200uL.置37℃湿盒内孵育8min10min。5.1.3.3.2.6取出玻片，用蒸馏水漂洗，晾干，光学显微镜下观察结果。5.1.3.3.2.7结果判定：正常细胞无颜色反应，滴加阳性血清的感染细胞其细胞核内有微棕红色，滴加阴性血清的感染细胞无颜色反应，即可判定结果。待检血清的感染细胞孔无颜色反应判为阴性，感染细胞核内有颜色反应者判为阳性。5.1.4病毒中和试验（VN）
5.1.4.1设备和材料
生物安全柜、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、电热恒温水浴箱、液氮贮存罐、微量可调加样器及配套吸头（1mL和200uL）、96孔细胞培养板、移液管。细胞：牛肾细胞或牛甲状腺原代或次代细胞、低代睾丸细胞。5.1.4.2试剂
DMEM培养基或其他培养基、胎牛血清、PBS、青霉素、链霉素、胰蛋白酶、EDTA及其他常规试剂，配制方法见附录B。
5.1.4.3操作方法
5.1.4.3.1中和病毒滴度（TCIDsa）测定5.1.4.3.1.1中和病毒制备
将保存于液氮中的AIHV-1种毒（WC1I株）取出，置于4℃缓慢融化，将融化的种毒用维持液适当稀释后，取1mL接种于长成单层的牛肾、牛甲状腺原代或次代细胞或低代睾丸细胞细胞瓶中，37℃吸附1h。用维持液洗涤1次后，再加人维持液，置于37℃二氧化碳培养箱中培养，当50%～75%细胞出现CPE时，收获病毒培养液，分装成1mL，一70℃保存备用。5.1.4.3.1.2病毒滴度测定
牛肾细胞经常规传代培养，接种96孔细胞培养板，实验前将培养板中旧的培养液吸出。取一管分装好的待滴定AIHV-1病毒液用10%胎牛血清DMEM生长液作10-1，10-?....10-\系列稀释，每一稀释度的病毒接种8孔，每孔25μL。设置正常细胞对照4孔～8孔，以DMEM生长液代替病毒液。每孔3
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补加培养液150μL～200μL后，将96孔板置37℃5%二氧化碳培养箱培养。如细胞对照正常，接种病毒的细胞出现CPE，记录试验数据。根据spearman-karber法计算TCIDso，确定25uL病毒液达到100TCIDs。时所需的稀释度。
5.1.4.3.2病毒中和试验
5.1.4.3.2.1待检血清经56℃水浴灭活30min.用10%胎牛血清DMEM生长液做1：2~1：16配比稀释后，加人96孔细胞培养板内，每个稀释度4孔，每孔25μL。同时设置阳性及阴性血清对照孔。5.1.4.3.2.2每孔分别加人25L100TCID。的AIHV-1病毒液.37℃C孵育1h。5.1.4.3.2.3将剩余病毒作10-、10-2、10-3、10-4稀释，每孔25μL，每个稀释度4孔。5.1.4.3.2.4将牛肾细胞悬液调整至3×10°个/mL.每孔加50μL。5.1.4.3.2.596孔细胞培养板置37℃5%二氧化碳培养箱培养7d~10d.显微镜下观察CPE，5.1.4.3.2.6根据spearman-karber法计算中和50%病毒的血清稀释度作为待检血清的效价。阴性血清在1：2稀释倍数下应没有中和作用。5.1.5竞争抑制酶联免疫吸附试验（CI-ELISA）5.1.5.1设备和材料
酶标板、洗板机、4℃冰箱、单孔道和多孔道微量可调加样器及配套吸头（10L、200L和1mL）。5.1.5.2试剂
包被抗原、标准阳性血清、标准阴性血清、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体（MAb-15A），均由指定单位提供，
包被液、封闭液、洗液、抗体稀释液、底物溶液、终止液等，配制方法见附录B。5.1.5.3操作方法
5.1.5.3.1用包被缓冲液将半纯化的MCF病毒抗原（AIHV-1WC11株或Minnesota株）作适当稀释，包被酶标板，每孔加入50μL（含0.2μg病毒抗原），4℃孵育18h～20h。5.1.5.3.2倒掉孔内液体，在吸水纸上拍干，加人洗液（PBS-T)300uL洗板3次，并充分除去孔内剩余液体（以下洗板方法同此）。5.1.5.3.3加入封闭液，每孔100μL，室温（21℃～25℃）静置2h。倒掉孔内液体，晾干后，4℃保存备用。
5.1.5.3.4待检样本（血清或血浆）用PBS-T洗液1：5稀释后.加人酶标板，每孔50μL，每个样本加2孔，封板后室温孵育1h。同时设置4个阴性对照孔，2个阳性对照孔和1个空白对照孔，阴性和阳性血清同法稀释，空白对照以PBS-T洗液代替5.1.5.3.5倒掉孔内液体，洗板后，在各孔中加人50μL工作浓度的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体（MAb-15A)）溶液，封板后室温孵育1h5.1.5.3.6倒掉孔内液体，洗板后，在各孔中加人100μL，TMB底物溶液，室温孵育1h。5.1.5.3.7在各孔中加人100μL终止液终止反应。使用酶标仪，于450nm波长下测定OD值，记录试验数据。5.1.5.3.8
5.1.5.3.9结果判定按式（1)进行：ODmml×100%此内容来自标准下载网
ODacgtive
式中：
抑制百分比，%；
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ODample待检样本OD值的均值；
ODnogive阴性对照OD值的均值。SN/T2855—2011
当阴性对照OD值的均值为0.4～2.1.阳性对照PI≥25%时，试验成立，否则试验不成立。当样本PI≥25%时，判为阳性；当样本PI<25%时，判为阴性。5.2绵羊疱疹病毒2型（OvHV-2型）5.2.1聚合酶链式反应（PCR）
5.2.1.1设备和材料
生物安全柜、电热恒温水浴箱、台式高速离心机、冰箱、普通PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、1.5mL离心管等。
5.2.1.2试剂
DNA提取试剂盒、70%乙醇、异丙醇、TaqDNA聚合酶、dNTP、琼脂糖、溴化乙锭、DNA相对分子质量标志物、PCR扩增预混试剂、各种分子生物学常用化学试剂（分析纯）。5.2.1.3操作方法
样品的采集和送检
5.2.1.3.1
按照5.1.1.3.1的方法采集和送检样品。5.2.1.3.2样品的处理
5.2.1.3.2.1抗凝全血的处理
取EDTA抗凝全血300uL，加入1mL红细胞溶解液，室温孵育10min，13000g高速离心20s，弃上清液。再加入0.5mL红细胞溶解液，重复上述步骤。加入500μLPBS，混勾洗涤细胞，13000g再次离心20s，沉淀细胞。弃上清液，加50μLPBS重悬细胞。5.2.1.3.2.2动物组织的处理
取病料组织5g，剪碎后置于研钵内，加入适量液氮进行研磨，称取研磨好的病料组织10mg～20mg转人新的1.5mL离心管备用
5.2.1.3.3DNA提取
5.2.1.3.3.1在上述细胞悬液中加入600μL核裂解液，吹打混匀细胞，直到无可见细胞颗粒。对于组织样本，加入600μL核裂解液后，65℃水浴15min～30min。5.2.1.3.3.2加3μLRNase到核裂解液中，反复颠倒5次，置37℃水浴20min.取出，冷却至室温。5.2.1.3.3.3加200μL蛋白沉淀剂.高速涡旋20s，冰浴5min。5.2.1.3.3.413000g离心4min，可见一白色蛋白沉淀。小心将含有DNA的上清液移至另一个干净的1.5mL离心管中，管中预先加人600uL室温异内醇5.2.1.3.3.5缓慢轻柔反复颠倒离心管直到出现可见线形DNA。室温13000g离心1min，小心弃去上清液。
1）本标准所用DNA提取试剂盒由Promega公司提供。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。试剂盒组成参见附录C。TKANYKAa
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5.2.1.3.3.6加人600uL室温70%乙醇，轻轻颠倒离心管数次以洗涤DNA，室温13000g离心1min，小心弃去上清液。
5.2.1.3.3.7将离心管倒置在干净吸水性强的滤纸上空气干燥约15min。5.2.1.3.3.8加入50uLDNA溶解液，放置4℃过夜或65℃1h，使DNA充分水合。5.2.1.3.3.9将DNA溶液放置4℃保存，如需长期保存需一20℃冷冻保存。5.2.1.3.4
套式PCR
5.2.1.3.4.1
PCR反应
第一轮反应
第二轮反应
引物序列
556：5-AGTCTGGGTATATGAATCCAGATGGCTCTC-3775:5-AAGATAAGCACCAGTTATGCATCTGATAAA-3556:5\-AGTCTGGGGTATATGAATCCAGATGGCTCTC-35555°-TTCTGGGGTAGTGGCGAGCGAAGGCTTC-35.2.1.3.4.2PCR反应体系
片段大小
扩增反应总体积为50μL：包括2μgDNA，10mmol/LTris-HCl(pH8.3）、50mmol/L氯化钾、2mmol/L氯化镁、0.01%（体积分数）明胶、10%DMSO、200μmol/LdNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、1μmol/L引物、2UTaqDNA聚合酶。取第一轮PCR反应的扩增产物2μL，作为第二轮反应的DNA模板，5.2.1.3.4.3PCR反应参数
94℃3min，1个循环；94℃20s.60℃30s72℃30s，25个循环；72℃5min，1个循环。两轮PCR反应的反应参数相同。
5.2.1.3.4.4琼脂糖凝胶电泳
将适量5XTBE稀释成1XTBE溶液，配制溴化乙锭含量为0.5μg/mL的1.8%琼脂糖凝胶。取10μLPCR产物，与2uL上样缓冲液混匀后，点样进行电泳。同时使用DNA相对分子质量标志物点样，以判断PCR产物片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm～5V/cm长度，当溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源，电泳检测结果用凝胶分析成像系统记录。5.2.1.3.4.5结果判定
用已知感染OvHV-2病毒的病畜组织DNA作阳性对照，正常动物组织DNA作阴性对照，等体积的水代替模板DNA作空白对照。
对样品进行PCR检测，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，而样品未出现预期大小的扩增条带，则可判定样品OvHV-2病毒阴性。如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和样品出现预期大小的扩增条带，对PCR产物进行测序分析比对,PCR产物核酸序列与OvHV-2病毒DNA序列相一致，则可判定样品OvHV-2病毒阳性。PCR目的片段DNA序列参见附录D8
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5.2.1.3.5荧光PCR
5.2.1.3.5.1
引物、探针序列
上游引物：5'-TGGTAGGAGCAGGCTACCGT-3”下游引物：52-ATCATGCTGACCCCTTGCAG-3探针:5-FAM-TCCACGCCGTCCGCACTGTAAGA-TAMRA-35.2.1.3.5.2PCR反应体系
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扩增反应总体积为25μL：包括12.5μLTaqManUniversalMasterMix2，240nmol/L上游引物，600nmol/L下游引物，80nmol/L探针，50μgDNA。5.2.1.3.5.3PCR反应参数
50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃1min，40个循环。5.2.1.3.5.4结果判定
阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。
检测样品的Ct值≥40时，则判定OvHV-2病毒阴性。检测样品的Ct值≤35时.则判定OvHV-2病毒阳性。检测样品的35OvHV-2抗体只有通过用AIHV-1做抗原才能检测到。按照5.1.2和5.1.3的方法，进行IFA、IPT试验，可检测OvHV-2抗体。由于牛疱疹病毒4型（BHV-4)与AIHV-1有交叉反应，因此试验的阴性对照.应同时设置BHV-4感染的单层细胞。只有在AIHV-1感染细胞视野出现特征性病变（细胞核内有抗原分布，有少量或无细胞质着染），而BHV-4感染细胞不出现时，才能将血清判为阳性。按照5.1.5的方法，进行CI-ELISA试验，也可检测OvHV-2抗体。但由于个别绵羊抗体对AIHV-1的交叉反应位点识别能力不同，以至于不能检测部分血清中的抗体，对CI-ELISA阴性结果的解释应该谨慎。2）本标准所用PCR扩增预混试剂（TaqManUniversalMasterMix）由ABI公司提供。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。试剂盒组成参见附录C9
SN/T2855—2011
附录A
（资料性附录）
恶性卡他热概述
恶性卡他热（malignantcatarrhalfever，MCF）是多种偶蹄动物的一种急性、全身性、常致死性疾病。本病最常感染牛亚科和鹿科动物，猪、山羊、猬羚、非洲紫褐羚、曲角羚、大辫羊、兔等对恶性卡他热也有易感性的报道。MCF主要由两种-疱疹病毒引起：猬羚疱疹病毒1型（alcelaphineherpesvirus-1，AIHV-1)和绵羊疱疹病毒2型（ovineherpesvirus-2，OvHV-2）。前者的自然宿主为非洲大羚，常呈不明显感染，是非洲区域的牛和世界范围内野生动物保护区中多种反台动物MCF的病原；后者作为亚临床感染在绵羊中流行，是世界绝大多数地区MCF的病原。在这两型疾病中，临床病畜并不是病毒的传染源其自然宿主非洲大羚和绵羊向外排毒本病临床症状变化很大，从死前只有少数症状的急性型到以高热、双侧角膜浑浊、眼卡他性分泌物增多、鼻口部坏死、口腔上皮溃疡为典型特征的慢性病例，不尽一致。AIHV-1病毒可通过临床感染动物外周血白细胞、淋巴结和脾脏细胞悬液以及非洲大羚的外周血白细胞或其他器官细胞悬液获得，OvHV-2病毒目前还没有正式得到分离鉴定，可选择PCR方法进行诊断。AIHV-1病毒的自然宿主非洲大羚可持续产生抗体，多种免疫学方法均可检测；临床感染动物的抗体反应则十分有限，常无中和抗体产生，可采用免疫荧光法、免疫酶法、竞争抑制酶联免疫吸附试验检测。OvHV-2抗体只能用AIHV-1型抗原检测，可采用免疫荧光法、竞争抑制酶联免疫吸附试验等方法，超急性感染动物通常无抗体存在。
本病发生于世界各地，一年四季均可发病，更多见于冬季和早春，多呈散发，有时呈地方流行性。多数地区发病率较低，但病死率可高达60%～90%，给养殖业带来严重损失。该病被列入OIE疫病名录，我国将其列为二类动物疫病。
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