【国家标准】 食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定

中华人民共和国国家标准
GB 4789.342012
食品安全国家标准
食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定2012-05-17发布
中华人民共和国卫生部
2012-07-17实施
本标准代替GB/T4789.34-2008
3《食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验》。本标准与GB/T4789.34-2008相比，主要变化如下修改了标准的中文名称；
-修改了培养基和试剂；
一删除了果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）测定和双歧杆菌的计数方法GB4789.342012
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定本标准规定了食品中双歧杆菌（Bifidobacterium）的鉴定方法。本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）恒温培养箱：36℃±1℃：
b）气相色谱仪配FID检测器：
c）冰箱：2℃~5℃；
d）天平：感量0.1g：
无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm：e)
GB4789.34-2012
无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器（200μL～1000μL）f）
及配套吸头；
g）无菌锥形瓶：500mL、250mL。3
培养基和试剂
3.1双歧杆菌培养基：见附录A中的A.1。3.2PYG液体培养基：见附录A中的A.2。3.3甲醇：分析纯。
3.4三氯甲烷：分析纯。
3.5硫酸：分析纯（体积比）。
3.6冰乙酸：分析纯（体积比）。3.7乳酸：分析纯。
3.8乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mol/L。
3.9乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。3.10乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mol/L。
3.11乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。1
4鉴定程序
双歧杆菌鉴定程序见图1。
样品25g（mL）+225mL灭菌生理盐水10倍系列稀释
选择2个～3个适当稀释度，各取0.1mL分别加入到双歧杆菌琼脂平板进行涂布厌氧，48h
36℃±1℃
挑取菌落接种于双歧杆菌琼脂平板厌氧，48h
36℃±1℃
革兰氏染色，过氧化氢酶试验
接种PYG液体培养基
厌氧，48h
36℃±1℃
测定乙酸、乳酸
生化反应
图1双歧杆菌鉴定程序
5操作步骤
5.1样品制备
5.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。GB4789.342012
5.1.2以无菌操作称取25g（mL）样品，置于装有225mL生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成1:10的样品匀液。
5.2稀释及涂布培养步骤
GB4789.34-2012
5.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
5.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按5.2.1操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。5.2.3根据待鉴定菌种的活菌数，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL稀释液，用L棒在双歧杆菌琼脂平板进行表面涂布，每个稀释度作两个平皿。置36℃±1℃温箱内培养48h+2h，培养后选取单个菌落进行纯培养。
5.3纯培养
挑取3个或以上的菌落接种于双歧杆菌琼脂平板，厌氧，36℃±1℃培养48h。5.4镜检及生化鉴定
5.4.1涂片镜检
双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。5.4.2生化鉴定
过氧化氢酶试验为阴性。选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌菌种主要生化反应见附录B。
5.5有机酸代谢产物测定
气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物，见附录C。6报告
根据镜检及生化鉴定的结果（5.4）、双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于1（5.5），报告双歧杆菌属的种名。
A.1双歧杆菌琼脂培养基
A.1.1成分
蛋白陈
酵母浸膏
葡萄糖
可溶性淀粉
氯化钠
西红柿浸出液
吐温80
琼脂粉
加蒸馏水至
A.1.2制法
A.1.2.1半胱氨酸盐溶液
附录A
培养基
15.0g~20.0g
GB4789.342012
称取半胱氨酸0.5g，加入1.0mL盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。A.1.2.2西红柿浸出液
将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在100℃水浴中加热，搅拌90min，然后用纱布过滤，校正pH7.0，将浸出液分装后，121℃高压灭菌15min～20min。A.1.2.3培养基
将A.1.1所有成分加入蒸馏水中，加热溶解，然后加入半胱氨酸盐溶液，校正pH6.8±0.2。分装后121℃高压灭菌15min～20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃时使用。A.2PYG液体培养基
A.2.1成分
蛋白陈
葡萄糖
酵母粉
半胱氨酸-HC1
盐溶液
维生素K,溶液
氯化血红素溶液5mg/mL
加蒸馏水至
A.2.2制法
A.2.2.1盐溶液
称取无水氯化钙0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾1.0g，碳酸氢钠10.0g，氯化钠2.0g，加蒸馏水至1000mL。
A.2.2.2氯化血红素溶液（5mg/mL）称取氯化血红素0.5g溶于1mol/L氢氧化钠1.0mL中，加蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌15min~20min。
A.2.2.3维生素K溶液
称取维生素Kl1.0g，加无水乙醇99mL，过滤除菌，冷藏保存。A.2.2.4 培养基
GB4789.342012
除氯化血红素溶液和维生素K，溶液外，A.2.1其余成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.0，加入中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min～20min。临用时加热熔化琼脂，加入氯化血红素溶液和维生素K,溶液，冷至50℃使用。5
附录B
双歧杆菌菌种主要生化反应
双歧杆菌菌种主要生化反应见表B.1。表B.1双歧杆菌菌种主要生化反应项目
赤癣醇
D-阿拉伯糖
L-阿拉伯糖
P-核糖
D-木糖
L-木糖
阿东醇
B-甲基-D-木糖武
10D-半乳糖
D-葡萄糖
D-果糖
P-甘露糖
L-山梨糖
L-鼠李糖
卫矛醇
甘露醇
山梨醇
a-甲基-D-甘露糖武
α-甲基-D-葡萄糖武
N-乙酰-葡萄糖胺
苦杏仁武（扁桃武）
熊果试
七叶灵
水杨武（柳醇）
D-纤维二糖
28P-麦芽糖
P-乳糖
D-蜜二糖
D-燕糖
D-海藻糖（覃糖）
菊糖（菊根粉）
34D-松三糖
35D-棉籽糖
两歧双歧杆菌
(B.bifidum)
婴儿双歧杆菌
(B.infantis)
长双歧杆菌www.bzxz.net
(B.longum)
青春双歧杆菌
(B.adolescentis)
GB4789.342012
动物双歧杆菌
(B.animalis)
短双歧杆菌
(B.breve)
肝糖（糖原）
木糖醇
龙胆二糖
D-松二糖
D-来苏糖
D-塔格糖
-岩糖
L-岩糖
D-阿糖醇
L-阿糖醇
葡萄糖酸钠
2-酮基-葡萄糖酸钠
5-酮基-葡萄糖酸钠
表B.1（续）
两歧双歧杆菌
(B.bifidum)
双歧杆菌菌种主要生化反应
婴儿双歧杆菌
(B.infantis)
长双歧杆菌
(B.longum)
青春双歧杆菌
(B.adolescentis)
GB4789.342012
动物双歧杆菌
(B.animalis)
+表示90%以上菌株阳性；-表示90%以上菌株阴性；d表示11%～89%以上菌株阳性。注：
短双歧杆菌
(B.breve)
C.1双歧杆菌培养液制备
附录C
气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物GB4789.342012
挑取双歧杆菌琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种于PYG液体培养基，同时用未接种菌的PYG液体培养基做空白对照，厌氧，36℃±1℃培养48h。C.2标准液的配制
C.2.1乙酸标准溶液
准确吸取乙酸5.70mL加水稀释至100.0mL，摇匀，进行标定，配成约1.0mol/L的乙酸标准溶液。标定方法为：准确称取乙酸3g，加水15mL，酚指示液2滴，用1mol/mL氢氧化钠溶液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1mL1mol/mL氢氧化钠溶液相当于60.05mg的乙酸。C.2.2乙酸使用液
将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至20.0mmol/L。C.2.3乳酸标准溶液
准确吸取含量为85%～90%的乳酸0.84mL，加水稀释至100.0mL，摇匀，配成1.0mol/L的乳酸标准溶液。标定方法为：准确称取乳酸1g，加水50mL，加入1mol/mL氢氧化钠滴定液25mL，煮沸5min加入酚酞指示液2滴，同时用0.5mol/mL用1mol/mL硫酸滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1mL1mol/mL氢氧化钠溶液相当于90.08mg的乳酸。C.2.4乳酸使用液
将乳酸标准溶液用水稀释至20.0mmol/L。c.3方法
C.3.1乙酸的处理
取双歧杆菌培养液2.0mL~3.0mL放入10mL离心管中，加入0.2mL50%（体积比）硫酸溶液，混匀，加入2.0mL丙酮，混匀后加过量氯化钠，剧烈振摇1min，再加入2.0mL乙醚，振摇1min后，于3000r/min离心5min，将上清液转入另一试管中，下层溶液用2.0mL丙酮和2.0mL乙醚重复提取2次，合并有机相，手40℃水浴中用氮气吹至少量溶液存在，用内酮定容至1.0mL，混匀后备用。同样操作步骤处理乙酸标准和空白培养液。C.3.2乳酸的处理
取双歧杆菌培养液2.0mL~3.0mL放入10mL比色管中，100℃水浴10min，加入0.2mL50%（体积比）硫酸溶液，混匀，加入1.0mL甲醇，于58℃水浴30min后加水1.0mL，加三氯甲烷1.0mL，振摇3min，3000r/min离心5min，取三氯甲烷层分析。同样操作步骤处理乳酸标准和空白培养液。C.3.3气相色谱条件
色谱柱：长2m，内径4mm的玻璃柱，填装涂有20%DNP+7%吐温60（Tween60）的chromosorbwHP（80～100目）；柱温：110℃；汽化室：150℃：检测器：150℃：载气：（Nz）50ml/min；进样量1.0ul：外标法峰面积定量。乳酸标准溶液的气相色谱见图C.1，乙酸标准溶液的气相色谱见图C.28
图C.1乳酸标准溶液的气相色谱
C.4结果计算
图C.2乙酸标准溶液的气相色谱
样品培养液中乙酸或乳酸的含量按式（C.1）计算：X
式中：
A￥-A室
A标xC
X样品培养液中乙酸或乳酸的含量，单位为微摩尔每毫升（umol/mL）；A样—样品培养液中乙酸或乳酸的峰面积；A
空白培养液中乙酸或乳酸的峰面积；A标—乙酸标准或乳酸标准的峰面积；C
乙酸标准或乳酸标准的浓度，单位为微摩尔每毫升（umol/mL）。C.5允许差
相对相差≤15%
C.6结果判定
GB4789.342012
如果乙酸（umol/mL）与乳酸（umol/mL）比值大于1，可判定为是双歧杆菌的有机酸代谢产物。9
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