【行业标准】 葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法

华人民共和国入境检验检疫行业标准SW/ 214---200
葡萄苦腐病菌检疫鉴定方法
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2010-05-27发布
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本标准超市单位：中函检验检接科学研究院中伴人员其和然渐江昌人境检验检疫局。中华人国共和国新疆出人境险验检疫局：
本标滩起草人：棋洪忠、吴品珊、吴志梨、文正避。http://foodmate.net跪围
南药富质蘭检鉴定法
个标准谢定了班出境档物检疫中箭占离病商数检疫鉴是方法。本标准活目让川境前两果实和活条中商普激病菌的检疫和聚定原理
N2614-2010
带俏节搬病菌在寄主F的状、形念学特拆及分平牛将学特性是制定本标准沟卡要依锯3收器和用息
3.1侬器
生物品微镜（且测民功能），袜视星微镜，超净！作合，光照牛物培养销，天中，高压灭器。台成品速离心杭H汀求浴籍限扩兽疫，电漾仪鉴成像仪、用属
烧杯，二角瓶，望简：脊。毕养川（自径cm），载坡片，盖玻片，酒精灯，朔料研竹，移液器；侈液器头·离心管.液氮。
试培养离
41试剂
琼智粉。铃菩,菊糖斑脂糖，无菊双蒸杀。液氮，Tris-IICI化镁，盐酸,EDIA。氧氢化，乙酸钠，余化钟。1TA，A，永之醇，求酚激化（），三中燃另内醇醇蛋白酶Tq!NA案合酶:dN:PNA分 F量 Miriser,PCR特引物 PMA 和 PMA-2,实爽% PCR 异烂引物PMAPPMAI及臻针PMA+robe4?1.2培养基
马馋普葡萄榨增塔亲站(0A：铃药2002：假糖20x·琼20g，1c0)ml蒸水，火菌5聚宗方法
5.1症状捡查
病害症状参见附求A。
5.2分离培养
病健交界处划取边k为5mm1cmm的释品（成熟的浆果表皮）.70与精消需10~305.放在A培养基124：12h光叫/2h黑陪单养质2虎，特真销岗落山现，市转到PDA上线化，1
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5. 3生物学鉴定
辛d屏观认记录菌落追潮色分生了率分生产！和分生跑子使的彩状大小5. 4分了生物学鉴定
5. 4. 1 DNA 提取
搬（TAB方达联LVA现附B
5. 4. 2 CR 检测
箭菊毕满病菊的管越PR检测力法实灵光以R检测，方江见甜录，6鉴定特征
s.1 生学特性
6. 1. 1 病菌形态
分生独了盘：散生或学牛个寄红识为质或我皮下，就期理生，成熟后外露；黑包圆年形或杯形径 80 μt-~25t um,
分生孢了便儿心有隔质个期则分技、m中，产孢细施肠形或瓶预型，无色光剂。分牛饱子，中跑深色、将纺摊形到斯影、等部平，二湾纯，大小为（7.5um~10um）（3um~lμm),
病菌形态图见萨策C
6. 1. 2 菌溶特征
质色，紧致，气生菌丝稀硫，有熙色一阵产牛，常达择放出深综至黑色的分生抱子团，6.1.3分于生物学特征
常规P求检测结果，若在354>处为条节，引性与对照条带出现，可判定检测结果为阳性。实州荧光PC次检测结果，节供试样品于用对照的AM（值小于36，可判定检测结采为附性。7结果判定
形态学鉴是中，分离萧的形态特征与案括标台，可刘定为检出氧葡光离病菌：常规产物与定当标吻合，可判定为制案萨摘菌：实时氛光PCR检测结只鉴尔华标磁会列判为筒生落离病肉B菌种保藏
将分肉菌接在PA常券瑞的斜前主.待科询衣面布满菌丝后，对好斜面的盖了，置于4保存，每存转接复活
9复核
必要制由专家戏检测结生进行友核2
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及，1分类地位
英文：Bit:cretorgrape
（斑料性附浆）
曾衡苦离病商的相美瓷料
学名:Greenerin urola(Ber.&Cutis)Prithalingam曾用niaxrainmfiainenm
有性态;求确袭
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萄离病菌（Gnri）属岛出界人部分奇菊的裁培和牛
A.3病害症状
果实发病道常在近果带处出现斑痕，后率率产大变敏、烂。在浅门色浆果上产褐他逛.共「常者生龄纹状排列的分牛孢千款，整只发病时起为明显，案色浆点上衰现为衣面和糖有小泡，内有分生型了盔。浆果在感病几天后变软易脱落，此时装果的味道为最，魔病出此而得外。不貌落的聚果测变！、皱缩，与熙腐病，炭症病、房粘病较施区非汁症状为叶摘山姚浅色边缘不清班的病班，病潮叫环烧柄至整个时片，造成叶片下重，十粘掉游。新裆和嫩叶「可有黑褐色小点期差生介鸦，把，枝系「的痛状中要表在不沟勾的变色，病糖色、稍陷，与健速组交界处有脂黑得，4地理分布
美国、濮大利业、新西汽、当西、南业、齐店，印度、H木和中国台湾、我国大渐没有确记录。httn
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胞. 1 A提取方法
洲察性附
公工衡学鉴定
样本为植物纠织时，将植物组织法净评电以成小惠冷冻小液藏研离，放人1.5m.离心管中待川。样本为真菌时，收集菌丝放人1.m浸在波凝单的离心管中，需料格碾碎符用，离心管加300~5C0（AB缓含液（中含.1蛋嗨温：65C水浴113000离心！mim13mim保留！拍液：5ulTris饱和盼：三氯4烷：孕这游（体双为26：24：1)混勾c0离心mm-~m保留游液：i50叫烷：鼻成醇（体积24：）爆句13c00离心5rin-~13nin.保留1湾液：人1ml异内醉混.-70下放置1h.或-20C过夜：13000离心33min元DA洗流73Z能洗DNA沉茨，空温燥：30L-~60lTri5-EDTA缓神没溶解NA，待
3,2常规 CE 检测
特异件物GUA1环列5-GTGGOCCTGTAAAUCTTG-3GLA2序为3GGCGGCTAAGTGAACCTAAG-H.
25度应体系含：样品NA15，10xPCRer25u,m/氧化锁2 t..2.5 nmol/L dvrp 2ul., lo umol/l. iners . ! ul./c. E nL.5 U/gl. Tag DNA pot.ymcrase0.2OG.3同装设路准对吧以-F缓液代替A品PR发应条件为：预变性，81C5m：变学.91C：mn温火53%30872C45：3个循环-72 ℃ 1 nin :课在.
PCR产物的检额在1×TAE电泳缓冲液中.头填脂糖凝胶电泳，5V/cm，0.5%染色20mi。凝胶成像议分价统果。
.3实时脱光股检测
实时 PCR 引物F列 GUAPTCGGGTGGAGAAGC,GCA-P2,TCGAIGCACAACCAAGAGAT，TuQMan探针 GUA PH:H：-FAMTGCCGGTGGXCTGTAAACTCTTGT-TAMRA3，擦针端际记的费光报告为1AM：3萌标证的爽光灭本团为TAMRA，25友府休系今：样品DNA！xCRarffer2.32minol/L就化键2ul.2.Eminol/L.dNTps 2pd.2oμmol,1.Prinpra/ at1 pJ.,1:tanaoi/L探午 Probet171.5μl..5 L/ui.Tan NA oynerase: 3.3 yil..adH. l2. 2 al..授流循环为91心mir9次
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中些人岗儿原入境怖验按蕴
行业标准
葡菌苦腐病菌检疫鉴定方法
8N/1 2611: 2010
中阁标港山版社出版
北京复兴门乡一河北街1G号
妆编码：100045
网址 www, spe. uel. n
电话：8852394868517598
中医标游出嵌社案离印測」印剧并本 880×:830 :/16 印张 0.75半数 11 千学201年0月第版2310个后第一次印印激「80
书号：55065-2 21227
定价16.00元
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