【行业标准】 甘蔗花叶病毒检测技术规范

ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1804—2009
甘蔗花叶病毒检测技术规范
Technical criterion of Sugarcane mosaic virus detection2009-12-22发布
2010-02-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录A、随录B为现范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提山，前言
本标准由农业部热带作物及制品标雅化委员会归门NY/T1804—2009
本标准起草单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所、国家重要热带作物7程技术研究叶本标准主要起草人：刘芯听、健华、陈业渊。rKAoNrKAca
甘蔗花叶病毒检测技术规范
NY/T1804-2009
警告一一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围
本称准规定「书蔗花叶病毒（Sugarcanemosaituirus，SCMV)双抗夹心联免疫吸附测定（DASELISA)及反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分生物学检测方法。本标推适用于日撤种茎、甘蔗组培苗中的日能花让病毒的检测，2仪器和用具
2.1主要仪器
台式冷冻离心机、PCR仪、水斗电泳装置、凝胶成像系统、水浴锅、酶标仪、恒温养箱。2.2用具及耗材
微量移液器、研体、酶联板、离心管、PC浪管、移液器吸头。3取样
3.1种茎：取胶芽及其周围组织约10g，心叶约10g.4℃条件下保存，最多存放7d。3.2组培苗：敢川片1g-10g，4℃条件下保存，最多存放7d。4检测方法
4.1双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)法4.1.1样品制备
从取样（保存）材料中切取0.5g~1.0g组织，加人5ml.抽提缓冲液研磨，4000r/min离心5imin，取上清液作试样，1℃条件下保存备用，阳性样品为凹知带SCMV的材料或试剂盒提供的阳性对照，阴性样品为已知不带SMV的材料或试剂盒提供的阴性对照，按同样方法制备和保存。4.1.2操作步骤
4.1.2.1包被抗体：每孔加100μl.用包被缓冲液按.1浓度稀释的SCMV抗体，37℃保湿孵育2h~4h或2℃条件下保凝过夜。
4.1.2.2洗板：用PBST洗液洗板4饮，每次3min~-5min.4.1.2.3封闭：每孔加人200封闭液，37℃保凝孵育1h-2h。4.1.2.4洗板：同4.1.2.2。
4.1.2.5加检测样品：每孔加人100ul试样，设阴性、阳性和空白对照（样品挺取缓冲液），可根据需要设置重复，37℃条件下保孵育4h，或4℃条件下过夜。4.1.2.6洗板：同4.1.2.2。
4.1.2.7加酶标抗体：每孔加人100μL经FCI缓冲液稀释至工作浓度的碱性磷酸酯酶标记抗体，37℃保漩孵育2h~4h。
4.1.2.8洗板：同4.1.2.2
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4.1.2.9加底物溶液：衔孔加人100L含1mg/1LPNP的底物显色缓冲液，在室温下避光保湿孵育30min~60min。
4.1.2.10终止反应：每孔加人50L31ol/.NaH终正反应，在酶标仪上测定波长405m吸光值（OD4ns），并打印结果。
4.1.3结果判定
样品（I)u值/阴性对照（D5值大于或等十2，判为附性；样品OD4c值/阴性对照（D1s值小丁或等于1.5时判为阴性；样品ODAs值/阴性对照（D0s值在1.5～2之问，应经进一步确认4.2反转录-多聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法4.2.1 引物
:游了物 SCMV -F5: 5'-GAAGAWGTYTTCCAYCAAKCWGGAAC-3'(W -T/A,Y=C/T,K-G/T);
下游引物 SCMV·R3:5”AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC-3';预期扩增片段为90Gbp。
4. 2.2操作步骤
4.2.2.1总RNA提取
从取样（保存样品中切取1g样品，加液氮在大小合适的离心管或研钵中研磨成粉卡，转至2ml离心管，加600μl水饱和酚与6002×RVA抽提缓冲液，混勾，4℃12000r/min离心20min，上清转移至新离心管，加人等体积1m0./.LiCl，混匀斤4℃沉淀过夜，4℃12000r/min离心20min，沉淀用70%之醇漂洗数次，风-F，用30山DEPC处理过的水溶解，一70℃保存备用。采用RVA提取试剂盒的，操作让骤参照产品说明书。阳性样品为已带SCMV的材料或SCMV提纯液，阴性样品为已知不带SCMV的材料，按同样方法制备和保存。
4.2.2.2反转录及PCR反应
以样品总RNA，以及阴性、阳性对照总RNA为模板，可选旧一步法RT-PCR试剂盒进行反转录和 PC求扩增，实验步骤按产品说明书逆行。若不是采用一步法RT-PCR试剂盒.以SMV-R3为反转录引物，参照反转录酶产品说明合成cDNA，然后在PCR反应管中依次加人10×PCR缓冲液2μL、10rtmol/I.的四种脱氧核糖核件峻(dATP、dCTP、GTP.dTTP)混合液0.4uL、上、下游物各0.4L、cDNA模板10ng~20ng、TagDNA聚合酶0.25uL，根据cDNA模板的用量加人菌重热留水，使PCR反应体系达划20uL，每个试样3次重复。
以4000r/min离心10后，将FCR管放人PCR仪中，94%预热1min进行35次扩增循环（94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延仲1min），72℃延伸5mim。取出IR反应管，对反应产物进行电冰检测或4%条件下保存备用。
4.2.2.3扩增产物的电泳检测
将适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为1%的溶液，然后按每10mI.琼脂糖游溶液中加入5uL溴化乙锭济液的比例，加人漠化之锭溶液，混勾，稍适冷却后，将其倒人电泳板上，室温下凝固哦凝胶后，放人1×TAE缓冲液中。在每个泳道巾加入7.5μL的PCR产物（需和上样缓冲液混合），其中一个泳道中加人AA分了量标记，接通电源进行电泳4.2.2.4凝胶成像分析
电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像仪上或紫外投射仪.上成像，根据DNA分子量标记判断扩增山的的条带的人小，将电泳结果形成文件存档或用照相系统拍。2
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4.2.3结果判定
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如果用性对照和检测样品中同时出现日的扩增条带，而阴性对照、空白对照均不出现该条带，该样品判为阳性；
如果阳性对照出现目的扩增条带，而阴性对照、空凸对照及检测样品中均不出现该条带，则该样品判为阴性：
如果窄1、阴性对照山现目的条带，或阳性对照未出现口的条带，应重新进行RT-PCR检测。3
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附录A
（规范性附录）
双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-EIISA)法试剂及缓冲液配制A.1抗体或试剂盒
SCMV单克隆抗体，碱性磷酸酯酶标二抗，DAS-EI.ISA检测试剂盒均来自市售，A.2缓冲液及配制
除非另有说明，在分析中仪使用分析纯试剂，配制好的溶液在4℃条件下保存。A.2. 1 PBST 洗液(pII 7.4)
氯化钠（NaC1）8.00g，氯化钾（KC)0.20g，磷酸氢二钠（NaaIIP())1.1>g，磷酸二氢钾（KHPO)）0.20g,吐温-20(Tween-20)0.5mL,用蒸馅水溶解并定容至1000ml。A.2.2ECI缓冲液
牛血清蛋白（BSA)2.0g，聚乙烯吡咯烷酮（PVT,MW240G-1000>20.0g，骨氮化钠（NaN）0.2川蒸馏水溶解许定容至1030ml.。wwW.bzxz.Net
A.2.3包被液(pII9.6)
碳酸钠(Naz（))1.59g，碳酸氢钠(NaHC）2.93g，用蒸馏水溶解并定容至1000mLA.2.4通用样品提取缓冲液（pH7.4）亚硫骏钠（NaS()）1.3g，聚乙烯吡咯烷酮（PV，MWzA00-40x）20.0g温-20（1ccm-20）20ml.,鸡蛋清粉2.0g，用PBST溶解并定容至1000mL。A.2.5封闭液（pH7.4)
牛血清H蛋白（XSA)2.0g，聚乙烯吡咯烷酮（PVI，MW2430-40cx:）20.0K，用PRST溶解并定容至1 000 mI.
A.2.6PNP底物显色缓冲液（pH9.8)二乙醇胺（CHNO,）97ml氯化镁（MgCl.)0.1g，用盐酸（HC1)调pH至9.8.川蒸馏水溶解并定容至1000mL
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附录B
（规范性附录）
反转录-多聚合酶链式反应【RT-PCR]法试剂及缓冲液配制NY/T 1804—-2009
除非另有说明，在分析中使用分析纯试剂，所用试剂和缓冲液均川TEPC（焦碳二乙酷)处理过的双水配制。
B.1化学试剂
B.1.1三羟基氨基中烷(Tris）
B.1.2二水二胺四Z殿钠(FDIA-Na·2Ha)。B.1. 3二烷基磺酸钠(SI'S)。
B.1.4氮化锂(LiCl)，
B.1.5一氯甲烷(chloroform)。
B.1.6异成醇(isoimyi alcohol)。B. 1. 7
氯化钠(NaCI)。
亚硫酸钠（Na S))
溴化乙锭(EB)。
B.2分子生物学试剂
各10mmal/L.的四种脱氨核糖核苷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)混合溶液。B.2.1:
B.2.2TagDNA聚合酶（5单位/uL)及10×PCR反应级冲液（含25mmol/I.Mg2T）。B.2.3植物RNA提取试剂众，
B.2.4反转录酶及缓冲液，反转录试剂盒。B.2.5INA分了量标记。
B.2.6引物溶液：川TEPC处理过的水将上、下游引物分别配制成浓度为10 utol/1.的水溶液。B.3缓冲液
B.3.1RNA抽提缓冲液：20mmol/IL.TrisHCl(pH8.0>,1%「=.烷基磺酸钠.200mmol/L氯化钠.5Imo/LEDTA.1%业硫酸钠。
B.3.2加样缓冲液：称取溴酚忧250mg，加水10ml.在室流下过夜溶解；再称取二甲苯晴蓝250mg，用1mL水济解，称取蔗糖50g，用30mL水溶解，合并三种济液，用水定容至100mL，在4℃中保存。B.3.350×TAE缓冲液：取Tris242.2g，先巾300mL水加热搅拌辫解后，加100m500mmol/FIA的水溶液p8.0),用冰乙酸调p至8.0,用水定容到1000ml。5
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中华人民共和国
农业行业标准
甘蔗花叶病毒检测技术规范
NY/T 1804—2009
中国农业出版社用版
（北京朝阳区麦子店街18·号楼）（邮政编码：10012）
网i:：ccap.com.tn)
北点平环埭印刷」印刷
新华书店北京发行所发行各地新华5店经销*
开：本880mmX230mm1/16
字数？「
印张0.75
2009年12月北京第1次印刷
2C09年12月第1版
书号：16109·1972
定价：18.00元
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