【行业标准】 胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范

ICS65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1805--2009
胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范Technical criterion of Cucumber mosaic vius detection on pepper2009-12-22发布
2010-02-01实施下载标准就来标准下载网
中华人民共和国农业部发布
本标推的附录A、附录B为规范性附录，本标准出中华人民共和国农业部提出。小标雄巾农业部热带作物及制品标准化委员会灯，NY/T1805—2009
本标准起草单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所、国家重要热带作物工程技：术研究中本标准尘要起草人刘志听、1健华、牛立霞，陈业渊。YYKAoNarKAca
胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范NY/T1805—2009
警告一使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围
本标准规定了制椒种苗黄瓜花啡病每（Cucumabermosaicvirus，CMV)双抗夹心酶联免疫吸附测定(DASELISA)及反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分子生物学检测方泌。木标推适于却椒插条苗以及条苗序中的黄瓜花叫病毒的检测2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用丁本标准，然而，鼓刷根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适月于木标谁，NY/T360胡椒插条苗
3仪器和用具
3. 1 主要仪器
台式冷冻离心机、PCR仪、水平电泳装置、凝胶战像系统、电冰箱、水浴锅、酶标仪、恒温培养箱。3.2用具及耗材
微量移液器、研钵、酶联板、离心管,PCR管、移液器吸头。4取样
出现花叶症状的凝似病株或插条苗（见NY/T360），取显症哗片3片～5片；无症状植株或插条苗，取完全展开的谈绿期片3片5片。于4℃条件下保湿存放待检，最多存放7d。制样时从不同叶片剪最适量片组织，制备成混台样品。5检测方法
5. 1双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 法5.1.1样品制备
从取样(保存)材料中切取0.5g1.0g组织，加人5ml.抽提缓冲液研磨,4000 r/min离心5min，联上消液作试样，4℃条件下保疗备用、阳性样品为已知带CMV的材料或试剂盒提供的性对照，期性样品为巴知不带CMV的材料或试剂盒提供的阴性对照，同样方法制备和保存，5.1.2操作步骤
5.1.2.1包被抗休：每孔加100μL用包被缓冲液按T作浓度籍释的CMV体，37℃保凝孵育2h~4 h或4条件下保湿过夜。
5.1.2.2洗极：用PBST洗液洗板4次，每次3min~5nin，5.1.2.3甘闭：每孔加人200uI.封闭液，37保湿孵育1h-~2h1
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5. 1.2. 4 洗板:同 5. 1. 2. 2。5.1.2.5加检测样品：每孔加入100L试样，设阴性、阳性利空白对照（样品提取缓冲液），根据需要设置重复，37℃条件下保龈孵育4h，或4℃条件下过夜。5.1.2.6洗板：同5.1.2.2。
5.1.2.7加酶标抗体：每孔加人100uL经ECI缓冲液稀释至工作浓度的碱性磷酸酷酶标记抗体，37℃保湿孵育 2 l~ 4 h。
5.1.2.8洗板：尚5.1.2.2。
5.1.2.9加底物溶液：每孔加人100L含1m/mLPNP的底物显色缓冲液.在室温下避光保混孵育30 min--60 min.
5.1.2.10终止反应：每孔加人50ul.3mol/1.Na0H终止反应，在酶标仪上测定波长405m吸光值（OD4ms），并打印结果。
5.1.3结果判定
样品ODAo:值/阴性对照（)D值人于或等于2,判为性；样品OI240值/阴性对照（)D值小丁或等下1.5时判为阴性：样品（)DAos值/阴性对照(ODze5值在1.5至2之间，应经进一步确认。5. 2 反转录-多聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法5.2.1引物
上游物P1：5'-GATGGACAAATCTGAATC-3”；下游引物P2:5'-TCAAACFGCGGAGCACC-3'：预期扩增片段大小为657bp。
5.2.2操作步骤
5. 2. 2. 1 总 RNA 提取
取1品加液氮在大小合适的离心管或研钵中研磨成粉末，转垒2mL离心管，如600μL水饱和酚与600L2×RNA抛提缓冲液，混匀，4℃12000r/min离心20min，上清液转移至新离心管，加人等体积4mol/LLiCl，混勾后4沉淀过夜，4℃12000r/min离心20min，沉淀用70%乙醇漂洗数次，风干用30μLLEPC处理过的水溶解，70℃保存备用。深用RNA提取试剂盒的,操作步骤参照产品说明书。
阳性样品为已知带CMV的材料或（MV提纯液，阴性样品为比知不带CMV的材料·按同样方法制备和保荐。
5.2.2.2反转录及PCR反应
以样品总RNA，以及阴性、附性对照总RNA为模板，可选用一步法RT：PCR试剂盒进行反转录和PCR.扩增，实验步骤按产品说明书行。若不是采川一步法RTIR试剂盒，以P2为反转录引物，参照反转录酶产品说明合成cDNA，然后,在PCR反应管中依次加人I0×PCR缓冲液 3tL10IrI101/L的凹种脱氧核糖核目暖（ATP、dCTP.dGT、dTTP)混合液2.5μL、引物溶液（含1:下游引物）各2 uL、DNA模板20 ng～25 ng、TagDNA聚合酶（5U/L)0.5山，根据cDNA模板的用量加入无菌重蒸馏水，使PCR反应休系达到30μ.,每个试样3次重复
以4000r/mnin离心10s后，将PCR管放入PCR仪中。94℃预变性2min；94℃变性30s，54C退火30s,72℃延仲1.ir1in,30个循坏，晨后72C延仲10min。取L:PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存，
5.2.2.3扩增产物的电泳检测
将适量的琼脂糖加人1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，削制成琼脂糖浓度为1%的溶液，然后按2
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100rL琼脂糖辫液中加入5I漠化乙锭溶液的比例，加人澳化2锭液，混勾，稍冷却后，将其倒人电泳板上，室温下凝战凝胶后，放人1×TAE缓冲液中。在每个泳道中加人7.5ul.的TCR产物（需和上样缀冲液混合)，其中一个泳道中加人DNA分子量标记，接通电源逊行电泳。5.2.2.4凝胶成像分析
电泳结束后，将掠脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像仪上或紫外投射仪上成像，根据IDNA分子量标记判断扩增出的月的条带的大小，将电泳结果形成文件存档或川照相系统抗照。5.2.3结果判定
如果阳性对照和检测样品中同时用现目的扩增条带，而阴性对照，空内对照均不出现该条能，该样品判为阳性；
如果附性对照出现口的扩增条带，前例性对照、空白对照及捡测样品中均不出现该条带，则该样目判为阴性：
如果空白，阴性对照川现目的条带，或性对照米出现目的条带，应重新进行RT-PCR检测。3
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附录A
【规范性附录’
双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)法试剂及缓冲液配制A.1抗体或试剂盒
（MV抗血清或单克降抗体，碱性磷酸酯酶标二抗，T)ASELISA检测试剂盒均来白市售。A.2缓冲液及配制
除作另有说明.在分析中仪使用分析纯试剂，配制好的溶液在4℃条件下保存，A.2.1PBST洗液(pH 7.4)
氯化钠(NnCl）8.00，氯化钾（KCl)0.20g，磷酸氢二钠（NazIIP()）1.15g，磷酸二氮钾（KHP0)）0.20g.性温20(Tween-20)0.5ml.,F蒸馅水溶解并定奔至1000ml.。A.2.2ECI缓冲液
牛血消白蛋白（BSA)2.0g，聚乙烯吡略烷酮（PV1，MW2404x）20.0g，叠氮化钠（NaN3）0.2g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml
A.2.3包被液(pH 9.6)
碳酸钠（NazCO)1.59g，碳酸氢钠牛血清蛋1I(BSA)2.0，聚乙烯吡略烷（PVI，MW240e-c000）20.0g，川PBST溶解并定容至1 000 .
A.2.6PNP底物显色缓冲液(pH9.8)二乙醇胺（CH-NC),）97mL，氯化镁（MgCl.)0.1g.用盐龄（HCI)谢pH盗9.8，用蒸馏水溶解并定容至1000tmL。
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附录B
【规范性附录]
反转录-多聚合酶链式反应(RT-PCR)检测法试剂及缓冲液配制NY/T 1805—2009
除非男有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，所用试剂和缓冲液均用DEI\C（焦碳酸：乙酯)处理过的双蒸水配制。
B.1化学试剂
B.1.1:羟基氨基烷(Tris)，
B.1.2二水乙二胺四叫Z酸二钠(EDTA-2N·2II2O)。B.1. 3十二烷基磺酸钠(SDS)
B. 1. 4氯化锂(LiCl)。
三氯甲烷(ellorolorm)，
B.1.6醇(isoamylalcohol)
B.1.7氯化钠(NaC1)。
B. 1. 8 亚硫酸钠(Nas,S))。
B.1.9溴化乙锭(EB)。
B.2分子生物学试剂
B.2.1许10trmol/L的四种脱氧核糖核苷酸(dATP,dcrP,dGTP,dTTP)泥合溶液。B.2.2TagDNA案合酶（5单位/uL）及10XPCR反应缓冲液（含25mmol/LMg2）。B.2.3植物RNA提取试剂盒。
B.2.4反转录酶及缓冲液，反转录试剂盒。B.2.5LNA分厂量标记。
B.2.6可[物溶液：用DEPC处理过的水将1、下游引物分别配制成浓度为10μumo1/I.的水落液。B.3缓冲液
B.3.1RNA抽提缓冲液：20mmol/LTrisCl(plI8.0）,1%十二烷基磺酸钠，200mmol/I.氯化钠，5 mmol/L.EDTA,1%亚硫酸钠。
B.3.2加样缓冲液：称取溴酚蓝250mg.加水10mL在室温下过夜济解称取二甲茉鞘蓝250mg用10mL水解：称取糖50g，用30mL水济解。合并二种溶液，用水定容全100mL，在4℃中保存。B.3.350×TAF缓冲液：取Tris242.2%，先用300mL水加热搅拌溶解后，加100mI.500mmml/I.EID)TA的水溶液（pH8.0),用冰乙酸调pH至8.0,然后用水定容到1000ml.。5
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中华人民共和国
农业行业标准
胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范NY/T 180S:2009
中国农业出版社出版
（北京市朝阳区麦子站街18楼）（政编码：100125
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北京吕平环球印刷厂印刷
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J木880mm×1230mm：/:6
2009年12月第1版
印张0.75
宁数7千字
2009年12月北京第1次印刷
书号：16109：1978
定价：18.00元
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