【行业标准】 大豆品种纯度鉴定技术规程

ICS67.060
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1788—2009
大豆品种纯度鉴定技术规程
SSR分子标记法
Protocol of purity identification for soybean variety using-SSRmolecular markers
2009-12-22发布
2010-02-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准的附录A.附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提山并归口NY/T1788--2009
本标准负贵起草单位：全国农业技术推广服务中心，中国农业科学院作物科学研究所。本标准主要起草人：廖琴、陈应志、邱丽娟、常汝镇、关荣霞、李春广、干爱。T
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1范围
NY/T1788—2009
大豆品种纯度鉴定技术规程SSR分子标记法本标雅规定了大豆品种纯度的SSR分子标记检测技术规程。本标推适用于大豆品种纯度鉴定。2原理
简单重复序列（SSR)分布丁人豆整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点「重复单位的数目及序列可能不向，因而形成片段长度多态性。由于每个简单重复序列两端的予列是商度保守的单拷贝序列.因而可根据其两端的序列设计一对特异引物，利用P(R技术对单复序列进行扩增，扩增产物通过电泳进行分离，经硝酸银染色，可辫别SSR电冰谱带，通过选用品种问具有广泛多态性的SSR引物，根据PCR扩增）物电泳谱带差异（等位变异数)，鉴定大豆品种纯度。3仪器设备、试剂与耗材
参见附录A
4试剂配制
4.1DNA提取试剂
4.1.10.5mol/1.乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)(pH8.0)溶液称取ED1A186.1，倒人1000mL烧杯中，加800ml.去离了水溶解，用固休氢氧化钠调PH至8.0,再加去离子水定容至1000mL,混匀,过滤，在4℃条件下保存。4. 1. 21 mol/ L 三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-IICI)溶液(pH8. 0)称取Tris60.55g，倒人500mL烧杯中，加400rnl.人离子水溶解，用HCl调pII至8.0，再加去离水定穿至500mL，混勾，4C条件小保存。4.1.3TNA提取液
称取氯化钠(Nac1)14.6g,倒人500ml-烧杯中，加100inL去离子水溶解，加1mol/LTrisHCl溶液50ml，加0.5mol/LEDTA溶液50ml和SDS10g.用上离子水定容垒500ml.,60C水溶解，泥句。4条件下保存。
4.1. 4三氯甲烷/异戊醇(24+1)
取 240 mL 三氯甲烷利10 ml.异戊醇.混勾,4.2PCR扩增试剂
4.2.1四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs：dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合溶液配制取浓度为100mmol/L的dATP、dCTF，lGTP、dIIP储存液各20uL混合，加入920μL超纯水，配成终浓度为2mmol/LT作液。一.20℃条件下保存，4.2.2引物稀释
用超纯水分别配制正向(F)引物利反向(R)引物至浓度均为100umol/I的储存液，取10zl.储存液加人490超纯水配战2μIr10l/IT作液4.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂4.3.110×TBE缓冲液
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分别称取Tris108g.硼酸55g，倒人1000ml.烧杯中，加人800mL去离子水加热济解，再加人0.5mol/LEDTA济液37mL.混匀.定容至1000ml。4.3.26%(W/V)变性聚丙烯酰胺凝胶分别称取丙烯酰胺57和甲叉双丙烯胺3g，倒入100）ml.烧杯中，加人600mL去离广水，再加人50mL10×TBE，加人420.42g脉。川去离厂水定容至1000mL，混勾过滤。4℃条件下保存。4.3.3疏水硅烷工作液
取4mL疏水硅烷原液加人96mL三氯巾烷中，混勺，配制成4%工作液，4.3.410% (W/V)过硫酸铵(APS)
称取过硫酸铵0.1，加人1m去离子水，混勺。℃条件下保存（保存期7d）。4.3.51×TBE缓冲液
取10×IBE缓冲液500ml,加离子水 4500ml.混。4.3.66×加样缓冲液
称股激龄兰和-中青各 0.125 品:分别加入甲酰胺 49 mL和 0. 5 mol/I.的EDTA溶液(pI[8. 0)1ml,混勾,备H。
4.3.7硫代硫酸钠溶液（10mg/mL）取1g硫代硫酸钠,加人 100 ml.超纯水溶解4.4银染、显影试剂
4.4.1固定液10%冰醋酸）
取冰醋酸100mL，加去离子水900ml,混匀4.4.2染色液（0.1%硝酸银）
称取俏酸银1g.加去离了水1200ml.溶解，加1.5mL甲醛溶液（37%），混匀。4.4.3显影液(3%无水碳酸钠）
称取无水碳酸钠30g，加1000ml.去离水溶解，再加甲醛1.5mL和200μl.硫代硫酸钠游液（10mg/n），混乡
5引物(见资料性附录B)
6操作步骤
6.1试样制备
6.1.1常规种
每个品种取50粒种了，每粒种子反豚方问取等量红混合制样。6.1.2杂交种
每个品种取50粒种了，单粒制样6.2DNA提取
从制样中取50mg豆粉放人2mL离心管中，加70%叫L预热（60℃)的INA提取液60%水浴1h：每隔15分钟颠倒混勺一次，再加7001.苯酚/氯中烷（1：1)，轻轻混勾，室温静置30min.10000g离心10min，将上清液转移到一新的1.5mL离心管中，加等体积苯酚/三氯甲烷(1+1)，轻轻混匀，室溢静置10min，10000离心10tnit，将[清转移到一新的1.5ml离心管中，加人2倍体积无水乙醇，轻轻颠倒泥勾，10000离心10tmi.弃清液，用75%乙醇洗涤沉淀两次，风1残余乙醇，将沉淀济解在450μl超纯水中.加3山RNA酶（101g/mL）.37%水浴30mi，加等体积三氯甲烷/异成醇（24+1)，混匀，静置10min，10000g离心101nitl。将上清液转移至一新的1.5ml离心告中，如2倍体积的无水乙醇，颠倒混句，10000点离心10m1in，弃1清液，用75%乙醇洗涤沉两次，风残余么醇，将沉淀2
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溶解在200mL超纯水中。币紫外分光光度计检测I2VA浓度，将DNA稀释到20rg/l。—20℃条件下保存。
6.3PCR反应体系及程序
PCR皮应体系个1×的PcR缓冲液.150μnul/LdNTPs，150pmol/L正向[物、150pmo1/I反向引物，ITaDNA聚个酶，40g被测样品NA加双热水补足20I.。PCR反应程序为94℃预变性5min9变性30s，47℃退火30s，72%延伸30s，运行35个循环；72%延仲5mi1，4℃条件下保存。6.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
6.4.1玻璃板处理
用自来水将玻璃板清洗十净，晾十，冉H95%酒精擦洗1遍，下燥。在2mL离心管巾加人1IL无水2醇，1u冰醋酸，1亲和硅烷原液，操勺，均匀涂布无叫槽玻璃板上，在通风概中用.5m疏水硅烧工作液均句涂布叫槽玻璃板，操作过程中两快吸璃板分别处理，防止互相污染。6.4.2玻璃板组装
待玻璃板彻底十燥后：将塑料隔条整齐放在无叫槽坡璃板两侧.盖工叫栅玻璃板，夹了固定后，用水平仪检测玻璃胶室是否水·。
6.4.3灌胶
收6%的内稀酰胺胶50mJ.,加入50μl.TEMED和200L10%APS济液。轻轻遥匀，将胶缓缓灌入璃胶室，待胶空灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳，在案湿下合「h以上。6.4.4预电泳
拨山样品梳，冲洗凹槽处残余的胶，将玻璃板与中泳槽组装，在正极槽（下槽）和负极抑（.1:抑)加入1×TE级冲液，用吸管吸1XTBE彻底冲洗凹槽胶面，100W机功率预电泳20min，使凝胶预热，6.4.5PCR扩增产物变性处理
PCR产物中加5uL6×加样缓冲液，混匀后95℃水浴变性min.立即置冰水中冷却，6.4.6电泳
清除加样槽孔气泡和杂质，鲨齿朝下插人样品梳，每个加样孔加人L~-5uL样品，70W~100W恒功率电泳，使凝胶温度保持衣55%在右（温度过高穿易使玻璃板炸），至指示剂（二中苯背）接近胶板的底部时,结束电泳，
6.5染色
6.5.1固定
电泳结束后分开两块玻璃板，将附着凝胶的玻璃板没人10头冰醋酸固定液中，在播床1:30/mi摇句15min，取出胶板，放在水洗樽中，加人t000ml.蒸馏水，在橘床上摇上omin.6.5.2染色
从水洗槽中取出胶板，放入0.1%AgN(）染色液中，布摇床上30r/min摇染20min，取山胶板，用蒸馏水快速漂洗（时间不超过10 s)6.5.3显像
将胶板放入1000mI，3%碳酸钠显影溶液中，轻显动，待条带消晰后，迅速将胶板放入10%冰醋酸固定液中，定影5min。用蒸馏水潔洗胶板5min，取小晾下，将玻璃板放在观片灯上：，记录结果，拍照保行。
7统计与计算
7.1常规品种
如果SSR位点表现单一条带，则说明品种纯合：如果出现两个或多个条带的位点，则认为该品种在3
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该位点杂合，品种纯度(P)的数值以%表示、按公式(1)计算：S×100
式中：
P品种纯度：
S检测SSR位点数；
杂合位点数。
7.2杂交种
如果SSR位点表现双亲带型，则说明品种纯合：如果山现单个亲本带型或其他带型，则认为该种子为假杂种。品种纯度(P)的数值以为表尔,按公式(2)计算：Ni-Ns
武中：
PI—品种纯度：
N检测种了数；
N2-一非效亲带型的种子数。
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A.1仪器设备
附录A
（资料性附录】
主要仪器设备
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PCR扩增仪、测序胶电泳槽高压电泳仪（3C00V连续可调，のIA~-400mA连续可调：额定输出功率100W）、恒温水浴锅（0℃100℃）天平（精度0.01g.0.0001g各台）磁力搅拌器、高速台式离心机(11000r/min）、紫外分光光度计、高压火菌锅，紫外凝胶成像系统、酸度计、微量移液器（10 μI.200ul、1000μl）、冰箱、摇床、脱色槽、胶片观察灯、数橋照相机。A.2主要试剂（常规生化试剂等级要求为分析纯）乙二胺四乙酸“钠（ethylenediamine tctraaacetic acid disodiumsale，EDTANa）、三羟[基氨基川烷_tris（hydroxyimethyl)arninomethane，Tris_、盐酸（HICl)，十：烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfale，SLs)、三氯巾烷（ehlarufortu）、异戊醇（isoamylalcohol）、氢氧化钠（NaoII）、液氮氯化镁（MgCl2）、四种脱氧核糖核作酸（dNTPs：dATP、dcIT、dGTPdTIP)泥合溶液、物（riner）TaqDNA聚合酶（Tagpolymcrase)、丙烯酰胺（acrylamide）、甲叉双内烯酰胺（N,N-mcthyletnebisacrylamidle）、腺（urea）、水烷（bind-silanc）、疏水硅烷（rcpe）silanc）、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（ammoniunpersaliate，APS）、硼酸（bnricacid）、酰胺（formamide），溴酚兰（bromophcnolblue）、二甲本青(xylene cyanol)、冰酷酸(accticacid）、硫代硫酸钠(socium thiosulfatePentany drale）、硝酸银(silverni-trate,AgNOg)）醛液(a7)(formaldeehydesolution)A.3主要耗材
离心管（1.5ml.2ml.）、移液器配吸头（(10l、200μL、1000L）、96孔PCR板或200μLPCR壁臂、次性于套、坡璃板、长尾夹(5l mm）)。5
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Sat_oug
Sai_099
Sct 189
Sct_189
Sattoa2
Satu002
Saitos
Srtt005
Satt168
Sa11168
Sau18r
Satt180
Sait184
Sa-181
Satt ly?
Satt197
Sat216
Satt216
Satt230
SaLL230
Satt236
SaLt236
Satt239
Satt239
Sa11242
Sntt242
Satt243
Sa11243
Sa11267
Satt267
Ba11279
Sa1279
Sat1307
附录B
【资料性附录】
SSR引物名称及分子量范围
表B.130对SSR引物名称及分子量范围序
GCGAAAATGGEAGAGATAA
AATGCTALAAGAGGAATGAAATAA
GTTTIGGCAATGAT
AAAATCGCAAAACTTAGT
IGTGGGTAAAATAGATAAAAAT
TCATTTTGAATOGTTGAA
TATXTAGAGAAGAACTAAAAAA
GTCGATTAGGCTIGAAATA
CGCIIGUCCAAAAATTAATAGTA
CCATTETOXAAXTCAATCITATAT
TTGCGIITGICAGC
TTGATTGAAACXCAALIA
GCGCTATGTAGATTATXAAATIAK:
GCCACTTACTGTTAGTCAT
CAGTGGTTTTTCXT
AAGATACXXLAACATTATTTGTAA
TACCCTTAAICACXGACAA
AGGGAAGTAACACATTTAATCATCA
CXICAGCGTTAATAAAATAGGAT
CTCXXEAAATIIAACCTTAAAGA
GCGTGCTTCAAACAACAAACAACTTA
GCGGTTTTCAGTAXGTACKTAAAATAGAGCGOCAAAAAATGAATLACAAT
GXAAACAAICAACATTCTTGAAC
GCGTTGATCAGGTCGATTTTTATTTGT
GCGAGTGCCAACTAAGTACTTTTATGA
GGCATIGCACATTAGGTITICTGTT
GCGGTAAGATCAGCCATTATTTAAGAwwW.bzxz.Net
CAXGICIGACCIATTCTCAT
CACIGCTATTTTTAITI'T
GXCAAAAGHGAUGCACCAATAG
GCGGTGATCGGATGTTATAGIITCAG
GGCTGGCCTTTAGAAC
GCGTTGTAGGAAATTTGAGTAGTAAG
YYKAONarKAca
分下蛋(bp)）
206~-250
156-131
102-~151
141191
200-~235
2:5-~-256
138-186
135~190
112--218
203-227
210·~234
183~195
:77~-200
200-~236
222~245
172-~198
162-~183
连锁祥
Sat:309
SaLiSog
Se:1339
Satt339
Satt346
Satt346
Satt352
Se：352
Satt390
Satr390
Satt4:1
Sa-t53c
Sal1530
Satt565
Satt365
Sat571
Sat57!
Satt586
Sntt586
Satt588
Satth88
Sern59C
Sat1590
Satt59s
SattS96
表B.1（续）
GCGCOTICAAATIGGXTCTT
GCXTTAAATAAAAUCCGAAAT
TAATATGCTTTAAGTGGIGTGGTTATG
GTTAAGCAGTTCTCTCATACG
GGAGGGAGGAAAGTGTTGTGG
GCGCATGCTTICATAAGTTT
GCGAATGTATTTTTGTTTCTXATCAA
TGATAAGCCAAAAAATGGAAGCATAG
AGIGGCIGATAAAAAAAATACTCA
ATAATCCGGEACAATAATTU
GCTGCACXTTGATAAATAA
GGCACGAAAGTTTTICTGTAACA
CATGCATATTGACTTCATTATT
CCAAGCGGGIGAAGAGGTTTTT
GCGCUCGGAAGTTGTAATAACCTAAT
GCGOTCTCTTAIGATGTTCATAATAA
GGGTAGGGGIGGAATATAAG
GCGGGATXGCGGATGGIGAAAG
CCGGCCTOCAAACTUCAAGTAT
GUGCCCAAATGATTAATLACTCA
GCIGCATATCTAGTCIGATEGACT
GAGLAAAACCAAAGIGAAGAAC
GCGGATTTTTTAAGTTAATGTICT
GGGCAGTTAGCGAATTATTTGIC
TOCTTCKYIXACCAAAT
CTCGATJKGTAGAA
NY/T1788—2009
分员(bp）
125--116
210-~24C:
185~~217
183-~195
102~-223
233--250
212~246
159-·193
[26~-1::
174--219
122-~173
262-~340
233~-291
连锁群
NY7T1788-2009
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SSR分子标记法
NY/T 1788200S
中国农业出版社出版
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北京吕环球印刷厂印刷
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开本88CmmX1230mm1/16
2009年12万第1版
印张0.75
字数7下字
200S年12月北京第1次印刷
书号：16109+2020
定价：18.00元
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