【商检行业标准(SN)】 化妆品微生物检测方法 第7部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2206.7—2010
化妆品微生物检测方法
第7部分：蛋白免疫印迹法检测
疯牛病病原
Determination of microbiological in cosmetics-Part 7:Determination of bovine spongiform encephalopathy (BSE) bywesternblotmethod
2010-03-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
金伙伴网
2010-09-16实施
SN/T2206《化妆品微生物检测方法》系列标准共分为7部分：第1部分：沙门氏菌；
第2部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；第3部分：肺炎克雷伯氏菌；
第4部分：链球菌；
第5部分：肠球菌；
第6部分：破伤风梭菌；
第7部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原。本部分为SN/T2206的第7部分。
本部分附录A为规范性附录。
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本部分主要起草人：马贵平、史喜菊、李炎鑫、刘全国、李冰玲、刘旭辉。本部分系首次发布的检验检疫行业标准http：//foodmate.netSN/T2206.7—2010
1范围
化妆品微生物检测方法
第7部分：蛋自免疫印迹法检测
疯牛病病原
SN/T2206的本部分规定了进出口化妆品中疯牛病病原检测本部分适用于化妆品中疯牛病病原的检测2规范性引用文件
SN/T2206.7—2010
蛋白免疫印迹法。
下列文件中的条款通过SN/T2206的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T6682分析实验用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求化妆品卫生规范（卫生部）
3缩略语
下列缩略语适用于SN/T2206的本部分。3.1
westernblot
蛋白免疫印迹。
蛋白。
细胞型蛋白。
致病性蛋白。
蛋白酶K。
苯甲基磺酰氟。
tris base
三(羟甲基)氨基甲烷。
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TTTEITETT:
SN/T2206.7—2010
十二烷基硫酸钠。
SDS-PAGE
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。3.10
聚偏二氟乙烯。
磷酸盐缓冲盐水。
电化学发光
4主要仪器设备
生物安全柜（2BIⅡI型）。
台式高速离心机（最高离心力可达12000g以上）。4.3
系组织匀浆机。
垂直电泳系统（含转印装置）。4.5
水浴锅（温度可达到100℃土1℃）。恒温培养箱（37℃土0.5℃）。
X光片洗片机。
磁力搅拌器和搅拌子（可以加热）。微量可调移液器（2μL、10μL、100μL、1000μL)和相应吸头。各种冰箱（精度分别达到4℃士3℃、-20℃士5℃和-70℃±10℃）。4.11
高压灭菌锅（温度可达到135℃）。4.12
PVDF转印膜（0.45μm）。
方法原理
疯牛病的病原是宿主细胞编码的一种正常蛋白质的异构体，这种正常蛋白简称为PrP°，其异构体简称为PrPs。正常的PrP对蛋白酶K敏感，不致病；但其异构体PrP对蛋白酶K有抗性，可致病.称为病毒（prion）。将被检化妆品制备成可溶性溶液，分成两等份，一份用蛋白酶K消化，另一份不用蛋白酶K消化，然后进行蛋白质电泳和转印试验.在PVDF膜上进行抗原抗体反应。如果出现特异性条带，即可判定被检化妆品溶液中存在PrPc。6试剂
6.112%Tris-Glycine预制凝胶（或自制12%Tris-甘氨酸-SDS聚丙烯酰胺凝胶）。6.2PrP单克隆抗体（鼠抗PrPIgG1.如6H4)。6.3辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG。2
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TEITER
6.4裂解缓冲液（配方见附录第A.1章）。6.5SDS-PAGE上样缓冲液（配方见附录第A.2章）。6.6电泳缓冲液（配方见附录第A.3章）。6.7电转缓冲液（配方见附录第A.4章）。6.8PBS(pH7.4)（配方见附录第A.5章）。6.9PBS-Tween20（配方见附录第A.6章）。6.10PK储存液（配方见附录第A.7章）。6.11ECL(电化学发光增强剂，配方见附录第A.8章）。6.12PMSF（蛋白酶抑制剂，配方见附录第A.9章）。6.13DMSO(分析级纯）。
6.14乙醇（分析级纯）。
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6.15实验用水：所有试剂的配制用水应为蒸馏水或去离子水，符合GB/T6682的要求。7操作步骤
7.1样品制备
7.1.1被试化妆品应在使用前制备。按照卫生部《化妆品卫生规范》中有关规定，根据溶解性不同，水溶性化妆品用PBS作溶剂，脂溶性化妆品用DMSO或乙醇作溶剂，制成终浓度为10%的溶液。如果需要，可以使用涡旋混合或超声波处理或37℃加热等来帮助溶解：7.1.2取上述溶液0.7mL加人到1.5mLEppendorf管中，再加人0.7mL裂解缓冲液，振荡混匀，2000g离心5min。
7.1.3将上清液转移到一个新的1.5mLEppendorf管中。7.1.4将上述上清液390μL加人到一个新的1.5mLEppendorf管中，并加人10μL2mg/mLPK（PK终浓度为50μg/mL），37℃温箱中反应1h后，再加人8μLPMSF（1mg/mL）终止PK反应，该样品称为样品+。7.1.3中剩余的没有用PK消化的上清液称为样品-。7.1.5试验中对照为重组PrP°，不用进行PK处理，直接进行SDS-PAGE检测。7.2蛋白免疫印迹试验
7.2.1制备SDS-PAGE样品：取被测样品-*和样品+冰以及阴、阳性对照品各30μL，分别加入到四个1.5mLEppendorf管中，再分别加人等量的上样缓冲液，振荡混匀。沸水煮10min后冷却至室温，即为制备好的SDS-PAGE样品。
7.2.2SDS-PAGE电泳：除去预制凝胶的外包装，用记号笔标记上样孔的位置.撕去预制凝胶底部的凝胶封闭条·拔出梳子，将预制凝胶放人电泳槽内，按要求固定好，加人电泳缓冲液。将每个制备好的SDS-PAGE被测样品-pk和样品+p及阴、阳性对照品分别加入到预制凝胶的四个相邻的孔中，每个孔中加人15uL。每次试验均设蛋白质分子量标准Marker。将电泳槽与电泳仪的电源线连接好，在电压200V下，电泳45min～60min（样品接近凝胶底部为止）。7.2.3电转（蛋白质从预制凝胶转移到PVDF膜）：剪切与海绵垫大小相等的两张滤纸和一张PVDF膜，将滤纸和海绵垫在电转缓冲液中浸透；PVDF膜先经甲醇浸透（2min～3min）后，再浸人电转缓冲液。按下述图1所示将海绵垫、滤纸、电泳后的凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫依次放好，将转印装置一起放电泳槽中，加人电转缓冲液，在电压25V，电流110mA下电转1h。需要特别注意的是，海绵垫、滤纸中不能含有气泡，
雪品伙伴网ht：
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正极（+）
负极（-）
NNNNNMNNNNN
海绵垫
海缩挚
转印膜
海绵垫
激细垫
图1蛋白质从凝胶转移到PVDF膜装载示意图7.2.4电转完成后，将PVDF膜放人20mL用PBS-Tween20配制的5%的脱脂奶粉溶液（以下简称封闭液）中，室温振荡反应1h（也可4℃过夜）。7.2.5倒掉上述奶粉溶液，将PVDF膜浸入PrP单克降抗体溶液（用封闭液按PrP单克降抗体说明书稀释比例配制）中，室温振荡反应1h（也可4℃过夜）。7.2.6倒掉PrP单克隆抗体溶液，PVDF膜用PBS-Tween20洗三次，每次5min。7.2.7将PVDF膜浸人辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体溶液（用封闭液按辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体说明书稀释比例配制）中，室温振荡反应1h。7.2.8倒掉酶标二抗溶液，PVDF膜用PBS-Tween20洗三次，每次5min。7.2.9将沥干的PVDF膜浸人到12mLECL溶液中，作用1min后取出，吸去多余液体，用单层透明的聚乙烯膜（polythenewrap）（也可用食品保鲜膜替代）包裹，立即送到暗室。7.2.10
在暗室中，剪切与PVDF膜大小相仿的X光胶片，与PVDF膜重叠放人喉曝光暗盒中曝光，直到阳性对照的强信号出现和膜背景或蛋白酶K带出现4min～8min左右，为了观察到最佳可见信号，曝光时间可以更长或更短；也可使用化学发光检测系统进行检测。8
结果判定
如果检测样品（PK+）在X光胶片上显示3条特异性信号带，则判为阳性：未出现特性条带则判为阴性。结果判定示意图见图2。
BSE(++)
BSE(+)
注：图中C带为重组PrPc对照.N带为阴性样品.BSE（十十）、BSE（十)分别为强阳性和弱阳性样品图2结果判定示意图
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TTEITETT:
生物安全措施
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为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的实验室和实验人员检测疯牛病病原，所有培养物和废弃物应小心处置，严格按照GB19489中的有关规定执行。5bzxZ.net
http：//foodmate.netSN/T 2206.7—2010
A.1裂解缓冲液
N-十二烷基肌氨酸钠
0.01mol/LPBS(pH7.4)
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
此溶液最好新鲜配制，4℃保存不超过3d。A.21×SDSPAGE上样缓冲液
Tris Base
溴酚蓝
0.1%（终浓度）
加蒸馏水并调节酸碱度至终体积95mL，pH6.8。使用前每95μLSDS-PAGE上样缓冲液加人5μLβ-巯基乙醇A.310×电泳缓冲液
Tris Base
甘氨酸
用蒸馏水定容至1000mL。
A.41×电转缓冲液
甘氨酸
用蒸馏水定容至1000mL。
此溶液在4℃可保存1周。
PBS(pH7.4)
氯化钠（NaCI)
氯化钾（KCI)
磷酸氢二钠（NazHPO）
磷酸二氢钾（KH,PO,）
加800mL蒸馏水溶解用盐酸调pH值至7.4.再加蒸馏水至1000mL，121℃土2℃，20min高压蒸气灭菌后，室温保存。
A.6PBS-Tween20
100mLPBS(pH7.2)加人100μLTween206
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oodmate:net
A.7蛋白酶K（2mg/mL）贮存液
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以可溶性粉剂购人的蛋白酶K应以灭菌的50mmol/LTris（pH8.0），1.5mmol/L乙酸钙溶解，配制成浓度为2mg/mL的溶液，分装，在一20℃下保存。A.8ECL
增强化学发光免疫印迹检测试剂，包括A液和B液，使用前等量混合A液和B液，混合后尽快使用，每平方厘米转印膜至少需要0.125mL混合液，9100mmol/LPMSF（蛋白酶抑制剂）A.9
0.435gPMSF溶解在25mL正丙醇中，混匀，4℃避光保存http：//foodmate.netSN/T 2206. 7-2010
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
化妆品微生物检测方法
第7部分：蛋白免疫印迹法检测
疯牛病病原
SN/T2206.7—2010
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
2010年5月第一版
印张0.75
字数12千字
2010年5月第一次印刷
印数1—1600
书号：155066·2-20840
http
://wuw.
定价16.00元
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