【商检行业标准(SN)】 单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2521—2010
单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法Serotyping of Listeria monocytogenes2010-03-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-09-16实施
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法SN/T2521—2010
中国标准出版社出版
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电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印剧厂印刷开本880×12301/16
印张0.5字数9千字
2010年5月第一次印刷
2010年5月第一版
印数11600
书号：155066·2-20857
本标准的附录A为规范性附录，
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。SN/T2521—2010
本标推主要起草人：曾静、魏海燕、张西萌、王金花、陈广全、张惠媛、饶红、付溥博、畅晓辉、张昕、汪琦、马旭。
本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。1范围
单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的血清分型方法。SN/T2521—2010
本标准适用于对单核细胞增生李斯特氏菌进行血清分型，单核细胞增生李斯特氏菌的溯源可参照本方法。
规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.30食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB19489实验室生物安全通用要求3设备和材料
台式离心机：1600g。
冰箱：4℃~6℃。
3.3McFarland浊度计。
3.4加热器。
3.5接种针。
试管：6mmX50mm。
试管架：适用于6mm
50mm试管。
移液器：适用于25μL，50μL，100μL恒温水浴：48℃。
无菌载玻片。
生物安全柜。wwW.bzxz.Net
培养基和试剂
SIM动力琼脂：见第A.1章。
胰蛋白磷酸盐肉汤(TPB)：见第A.2章。4.337%甲醛溶液。
4.40.85%灭菌生理盐水：见第A.3章。4.5
含0.5%甲醛生理盐水：见第A.4章。4.6O抗血清。
4.7H抗血清。
方法提要
待测菌株应是经鉴定确证为单核细胞增生李斯特氏菌的纯培养物，单核细胞增生李斯特氏菌的抗血清与李斯特属其他种之间存在交叉反应现象，所以错误鉴定的或不纯的培养物，在进行血清型鉴定时会得出错误的结果；H抗原，又称鞭毛抗原，H抗原位于细菌毛上，在鉴定H抗原时应使用有运动性1
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的菌袜；应先鉴定H抗原，后鉴定O抗原。单核细胞增生李斯特氏菌O抗原和H抗原的关系见表1。表1
血清型
检验流程
单核细胞增生李斯特氏菌血清型抗原结构0-抗原
V,M,X,X
(V),M,
V.M.().(X)
单核细胞增生李斯特氏菌血清分型流程见图1。H抗原的鉴定
挑取菌苔边缘
接种TPB培养基
培养18h~24h
25℃，
待测菌株
穿刺接种EB半固体
培养基（24h～48h，
25 ℃)
用含0.5%甲醛溶液处理菌体细胞25℃，包
保温4h
离心收集菌体（1600g，30min）用0.5%的甲醛生理盐水洗涤菌体细胞离心收集菌体，1600g，30min
调整细胞浓度≥3.0MaeFarland
血清型鉴定
O抗原鉴定
挑取菌苔中心
接种TPB培养基
35℃,18h~24h
H-抗原
加热菌体细胞2h
100℃，
1600g，30min收集菌体
0.5%的甲醛生理盐水洗涤菌体细胞600g，30min收集菌体
调整细胞浓度≥3.0MacFarland
血清型鉴定
单核细胞增生李斯特氏菌血清分型程序图7单核细胞增生李斯特氏菌血清分型方法7.1H抗原鉴定
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7.1.1将活化的待测菌株用接种针垂直穿刺接种于SIM动力培养基，25℃，培养24h48h。典型的单核细胞增生李斯特氏菌在EB半固体培养基上呈伞状生长，7.1.2挑取生长在SIM动力培养基伞状菌苔边缘，接种于TPB液体培养基，25℃，培养18h～24h。7.1.3在TPB培养液中加入37%甲醛溶液，使甲醛的终浓度为0.5%（在8mL的培养液中加人0.04mL的37%甲醛溶液），25℃处理菌体细胞4h。7.1.4离心收集菌体，1600g，离心30min。7.1.5重悬菌体细胞于含0.5%甲醛生理盐水中，调整菌体细胞浓度≥McFarlandNo.3，该菌悬液为标准菌悬液；也可以用经甲醛处理的单核细胞增生李斯特氏菌TPB菌悬液进行H抗原凝集反应，其凝集反应结果应与用0.5%甲醛生理盐水洗涤的标准菌基液相同7.1.6在6mmX50mm试管中分别加入100μL经稀释的H抗血清，A,C和D,与等体积经甲醛处理的菌悬液充分混匀，同时用0.85%灭菌生理盐水代替抗血清作为阴性对照，48℃水浴保温；在48℃水浴保温1h之后，用肉眼观察是否有凝集反应发生。凝集反应表现为：形成沉淀，上清液清激，有凝集反应发生，为阳性反应，可判定相应H抗原；如无凝集反应发生，则可判断为阴性反应。7.20抗原监定
7.2.1将活化的待测菌株接种于TPB液体培养基，35℃培养18h～24h，1600g，离心30min收集菌体，如果用玻片法进行凝集反应，用TPB培养基洗涤菌体细胞次；如果用试管法进行凝集反应，用含0.5%甲醛生理盐水洗涤菌体细胞一次。7.2.2玻片法
7.2.2.1用含0.5%甲醛生理盐水重悬菌体细胞，制成高浓度的菌忌液（菌悬液的浊度等于或高于McFarlandNo.3)，置25μLO抗血清于灭菌玻片上，与等体积的菌体抗原充分混合，同时用25μL，0.85%灭菌生理盐水与等体积的菌体抗原混合作为阴性对照，7.2.2.2用手握住载玻片的两边.在黑色背景衬托下，接近灯光进行观察。如果凝聚反应不典型，用试管法进行凝集反应。
7.2.3试管法
7.2.3.1试管法鉴定O抗原的方法与鉴定H抗原的方法基本相同。所不同的是将等体积混合的O抗血清和菌体抗原，48℃保温2h后，在4℃冰箱过夜，观察凝集反应结果；或是在48℃水浴保温过夜，观察凝集反应结果。
8血清型结果判定
根据H抗原和O抗原凝集反应结果从表1查到相应的血清型。9安全措施
为了保护试验室人员的安全，所有培养物和废弃物应小心处置。并按GB19489中有关规定执行。SN/T2521—2010
A.1SIM动力琼脂
A.1.1成分
硫酸铁胺
硫代硫酸钠
蒸馏水
附录A
(规范性附录）
培养基和溶液配制
1000mL
A.1.2制法
将上述各成分加热混匀，调pH7.2，分装小试管，121℃高压灭菌15min，备用。A.2胰蛋白磷酸盐肉汤(TryptosePhosphateBrothTPB)A.2.1成分
胰大豆琼脂
酵母抽提物
蒸馏水
A.2.2制法
1000mL
用孔径为20μm细菌过滤器过滤除菌。A.30.85%生理盐水
将0.85g氯化钠溶解于100mL蒸馏水中，分装，高压灭菌121℃，15min。A.4含0.5%甲醛的生理盐水
将0.85g氯化钠溶解于100mL蒸馏水中，加0.5mL的甲醛，分装，高压灭菌121℃，15min。书号：155066·2-20857
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