【商检行业标准(SN)】 进出口危险化学品安全试验方法 第16部分：Western-Blot实验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2497.16—2010
进出口危险化学品安全试验方法第16部分：Western-Blot实验
Test method of import and export dangerous chemicals-Part16：WesternBlot
2010-03-02发布
中华人民共和国
数码防
国家质量监督检验检疫总局
2010-09-16实施
SN/T2497《进出口危险化学品安全试验方法》系列标准共分为29部分：第1部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验；第2部分：空斑形成细胞(PFC)试验；第3部分：大型涵繁殖试验；
第4部分：酿酒酵母有丝分裂重组试验；第5部分：率丸细胞UDS试验；
一第6部分：哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验；第7部分：小鼠耳肿胀试验；
第8部分：窝淋巴结试验；
第9部分：血清溶血索测定试验；第10部分：T淋巴细胞增殖功能测定试验；第11部分：种系突变试验；
第12部分：单细胞凝胶电泳分析试验；第13部分：荧光原位杂交试验；第14部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验；第15部分：PCR-SSCP实验；
第16部分：Western-Blot实验；第17部分：哺乳动物行为毒理学试验；第18部分：DNA加合物的检测方法；第19部分：NorthernBlot实验；第20部分：Bradford法测定蛋白质含量；第21部分：琼脂糖凝胶电泳试验；第22部分：DNA的Tm值测定方法；第23部分：细胞器的分离实验方法；第24部分：细胞免疫功能体外检测方法；第25部分：体液免疫功能试验；第26部分：巨噬细胞功能试验；第27部分：流式细胞术检测凋亡；第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用；第29部分：生化需氧量（BOD)测定。本部分为SN/T2497系列标准的第16部分。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2497.16—2010
本部分负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：贾晓川、王利兵、于艳军、赵好力宝、王华、熊中强。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I
1范围
进出口危险化学品安全试验方法第16部分：Western-Blot实验
SN/T2497.16—2010
SN/T2497的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中Western-Blot实验的术语和定义、主要试剂、试验步骤和试验结果。
本部分适用于进出口危险化学品安全试验Western-Blot实验。2术语和定义
下列术语和定义适用于本部分。2.1
Western-Blot
一般称为免疫着色或免疫印迹，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
第一抗体firstantihody
以待测蛋白质作为抗原的对应抗体。2.3
第二抗体secondantibody
以碱性磷酸酶标记的，能够与第一抗体结合的抗体。3试剂
3.1转移缓冲液wwW.bzxz.Net
称取甘氨酸2.9g，Tris碱5.8g，十二烷基磺酸钠(SDS)0.37g，加适量水使固体溶解后，加入甲醇200mL，补水至1000mL。
3.210×丽春红S贮存液
称取丽春红S2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，加水溶解，定容至100mL，室温保存，用时稀释10倍。
3.3TBS溶液
称取Tris碱3g、NaCl8g和0.2gKCl，加水溶解后，用稀盐酸调pH值至7.4，定容至1000mL，在1.034×10°Pa(151bf/in*）高压下蒸汽灭菌20min，室温保存。3.4TBST溶液
在TBS中按1：1000加人Tween20，室温保存。3.5碱性磷酸酶缓冲液
100mmol/LTris·Cl(pH值9.5)，100mmol/LMgClz，100mmol/LNaCl，室温保存。3.6氮蓝四唑(NBT)贮存液
0.5gNBT溶于10mL70%二甲基甲酰胺(DMF)中。3.75-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)贮存液0.5gBCIP溶于10mL二甲基甲酰胺(DMF)中。SN/T2497.16—2010
3.8磷酸盐缓冲液(PBS)
称取8gNaCI、0.2gKCl、1.44gNazHPO.和0.24gKH,PO，溶于800mL蒸馏水中，用HCI调节pH值至7.4，定容至1000mL，1.034×10°Pa（151bf/in2）高压下蒸汽灭菌20min，室温保存。试验步骤
4.1聚丙烯酰胺凝胶的准备
将进行完SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后的凝胶浸泡于转移缓冲液中。4.2半干法转移蛋白质
将硝酸纤维素滤膜和六张相同尺寸的普通纸于转移缓冲液中浸泡5min。由下至上安装转移装置：阳极板-三层滤纸-滤膜-凝胶三层滤纸-阴极板，根据凝胶面积按0.65mA/cm2接通电流，转移1.5H2h。
将转移后的硝酸纤维素滤膜用水冲洗，丽春红染色，然后标记标准蛋白质的位置并用水冲洗干净。如采用预染标准蛋白，可省却此步骤4.3封闭
用封闭液（含5%脱脂奶粉的TBS)于平板播床上摇动封闭1h。4.4
第一抗体结合
按0.1mL/cm的量加人适当比例稀释的第一抗体，在室温下持续摇动1h以上。弃去第一抗体工作液，用TBST洗涤滤膜5min，更换TBST后再洗涤20min再次更换TBST后洗涤5min，最后用TBS洗涤滤膜5min。4.5第二抗体结合
加人第二抗体工作液室温下持续摇动1h。弃去第二抗体工作液，以TBST漂洗研酸纤维素滤膜三次，每次10min，最后用TBS漂洗滤膜5min。
4:6显色
配制生色底物：将66μLNBT贮存液加入到10mL碱性磷酸酶缓冲液中，混匀，然后加人33μLBCIP贮存液，30min内使用。按滤膜面积加入9.1.mL/cm2的生色底物，当蛋白条带的颜色深度达到要求后，取出滤膜，浸人200μL0.5mm5结果保存
EPTA（pH值8.
拍摄滤膜照片，保存结果，滤膜可用热封机封合后保存，2
和50品LPBS中。
SN/T2497.16-2010
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
进出口危险化学品安全试验方法第16部分：Western-Blot实验
SN/T2497.16-2010
中国标准出版社出版
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中国标准出版社秦皇岛印剧厂印刷*
开本880×12301/16印张0.5字数6千字2010年6月第一次印刷
2010年6月第一版
印数1-1600
书号，155066·2-20949
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