【地方标准(DB)】 植物种苗组培快繁技术规程

ICS65.020.20
备案号：
浙江省地方标准
DB33/T752—2009
植物种苗组培快繁技术规程
Technical regulations for plant micropropagation2009-08-10发布
2009-09-10实施
浙江省质量技术监督局发布
各类标准行业资料免费下载各类标准行业资料免费下载前
1范围
2术语和定义
3组培工厂的设计要求、所需的仪器设备及化学试剂4组培苗生产流程
5培养容器和接种器械的清洗
6培养基的配制
7消毒灭菌操作
8培养材料和外植体灭菌
9接种操作
10培养室操作
11组培苗移栽和组培穴盘苗生产12质量标准
13包装、
标志、
（资料性附录）
（资料性附录）
（资料性附录）
（资料性附录）
（资料性附录）
（资料性附录）
（资料性附录）
（资料性附录）
（资料性附录）
常用植物组培术语和定义
植物组培苗生产流程图
组培工厂设计、所需面积及设计要求组培工厂所需的仪器设备
组培工厂所需的玻璃器皿及器材常用基本培养基成分表
植物组培常用化学试剂、药品一览表MS培养基母液配配制表
常用植物生长物质的母液配制
标准搜网各类标准行业资料免费下载DB33/T752—2009
DB33/T752—2009
本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F、附录G、附录H、附录I均为资料性附录本标准由浙江省农业厅提出并归口。本标准起草单位：浙江省农业科学院本标准主要起草人：陈剑平、徐刚、K.B.Kumar、汪一婷、吕永平、牟豪杰。I
各类标准行业资料免费下载1范围
植物种苗组培快繁技术规程
DB33/T752—2009
本标准规定了植物种苗的组培快繁的术语和定义、组培工厂的设计要求、所需的仪器设备及化学试剂、组培苗生产流程、培养容器和接种器械的清洗、培养基的配制、消毒灭菌、培养材料和外植体灭菌、接种操作、培养室操作、组培苗移栽和穴盘苗生产、质量标准及包装、标志、运输等内容。本标准适用于植物种苗的组培快繁技术规程管理的全过程。2术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。常用植物组培术语和定义参见附录A。2.1
组培苗plantlet
利用植物器官等作为外植体，采用植物组织培养技术生产的种苗，2.2
琼脂苗inagarplantlet
利用植物器官等作为外植体，采用植物组织培养技术生产的种苗、2.3
无琼脂苗exagarplantlet
从培养容器中取出并洗去琼脂后的组培生根苗。2.4
组培穴盘苗plugplant
移栽在穴盘中培育的组培生根苗。3组培工厂的设计要求、所需的仪器设备及化学试剂3.1设计要求
3.1.1组培工厂应建在排水设施良好，常年主风向的上风区。应远离各种污染源（如粉尘大的工厂、微生物工厂和繁忙交通干道），周边环境应干燥、安静、通风透光、空气清新。3.1.2组培工厂新建建筑地基应高出地面30cm以上，楼顶不应有渗漏；若建两层或三层，宜安装简单载物电梯；准备室、洗涤室、培养基配制室、灭菌室宜安排在楼下，接种室、培养室应防潮、隔热保温，宜安排在二楼、三楼。
3.1.3组培工厂各分区要布局合理，应根据生产工艺流程（参见附录B植物组培苗生产流程图），把各部分安排成一条连续、有序和通畅的生产流水线。3.1.4利用办公室、仓库等旧房进行改造的组培工厂，应合理安排，做到杜绝污染，方便工作，节省能源，使用安全。
3.1.5组培工厂设计包括组培车间：洗涤室、培养瓶晾干室、药品室（称量室）、培养基配制室、灭菌室、培养基储存室、更衣室、接种室、培养室、出苗室和贮物室；办公生活区：办公室、工作人员室和其它生活空间等；大棚温室：母本圃、组培苗驯化区、组培苗移栽圃和辅助用房等。3.1.6不同规模组培工厂设计、所需面积及设计要求参见附录C。3.2仪器设备及化学试剂
各类标准行业资料免费下载DB33/T752-—2009
3.2.1植物组培所需的仪器设备包括灭菌设备、培养设备和培养容器、实验设备、办公用品和消防灭火设备等。不同规模组培工厂所需的仪器设备参见附录D。3.2.2组培所需的玻器皿及器材包括盛装器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿（量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。不同规模组培工广所需的玻璃器血及器材参见附录E。3.2.3常用化学试剂包括组培苗生产所用基本培养基所需的无机盐类和有机物类。常用基本培养基成分参见附录F。组培中常用的无机盐类、有机物类、植物生长物质、消毒剂、洗涤剂等参见附录G。4组培苗生产流程
4.1生产流程图
植物组培苗生产流程参见附录B。4.2新品种引进、母本圃种植
将引进的新品种植株种植在温室内，加强肥水管理，确保植株健壮，防治病虫害，减少植株表面附带的微生物和害虫。
4.3材料选择
从具有品种典型性状的健康植株上选择芽、茎或叶等植物材料作为外植体。4.4外植体灭菌
参见8.3外植体灭菌的方法将取得的外植体进行表面灭菌。4.5初代培养
在无菌滤纸上将表面灭菌处理后的外植体切割成所需大小，一般约为0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，接入初代培养基中进行培养。外植体初代培养20d～40d后，一般可诱导出幼芽。4.6增殖培养
将初代培养诱导形成的幼芽或丛生芽，转接到增殖培养基中进行培养。增殖培养周期根据培养材料及组培苗生长情况而定，一般培养周期为30d～60d；增殖培养代数控制在16代～24代以内，繁殖系数控制在2.5~4.0。
4.7壮苗培养
将增殖的丛生芽接种到壮苗培养基中，培养20d～30d后幼苗株高可生长达2cm～5cm。4.8生根培养
从壮苗培养的幼苗中切取生长健壮、叶色正常、叶片舒展、适于生根的无根苗，接种在生根培养基中进行培养，培养20d～30d后幼苗基部长出数根新根。4.9组培苗炼苗移栽
组培苗炼苗3d～7d后移入含蛭石、泥炭、珍珠岩等基质或混合基质的穴盘中。穴盘苗生产管理
穴盘苗在温室大棚中进行光、温、水、肥等管理，培育2个月～3个月，穴盘苗可长至10cm15cm高。
出苗、包装、运输
接本标准第13章包装、标志、运输的方法将琼脂苗、无琼脂苗和组培穴盘苗经包装后出售。5培养容器和接种器械的清洗
5.1培养容器的清洗
5.1.1浸范：新的培养容器（培养瓶、培养皿和试管等）直接放入洗洁精或洗衣粉溶液中浸范：用过的培养容器须先倒掉瓶中的培养基后再浸泡；污染的培养容器应先按7.1的要求进行高压灭菌，然后倒掉瓶内污染物再浸泡；浸泡时间不应少于6小时，一般为过夜。5.1.2洗刷：用瓶刷洗刷瓶内残留的培养基和瓶外的灰尘。5.1.3冲洗：将培养容器用自来水冲洗3遍~5遍。2
各类标准行业资料免费下载5.1.4晾干：把冲洗干净的培养容器倒放在培养容器专用框中晾干。5.1.5清洁标准：晾干的培养容器内外壁无明显的斑点、污迹。5.2接种器械的洗刷
DB33/T752—2009
5.2.1清理：清除接种器械（镀子、解刀柄、不锈钢碟等）上残留的培养基和培养材料。5.2.2清洗：在洗洁精溶液中浸泡数分钟，用钢丝球洗刷后用清水冲洗3遍～5遍。5.2.3灭菌：用棉布或纸等包好接种器械，按7.1进行高压灭菌5.2.4玻璃器血应小心轻放，避免打碎划破手。移取烫手的器械时应戴隔热手套（如棉手套或石棉防火手套）。若发生意外参见相关实验室安全规程处理。6培养基的配制
6.1培养基选择
根据培养材料生长发育特性选择合适的基本培养基种类和激素配比（常见基本培养基成分参见附录F）。
6.2化学试剂的选择和保存
应符合附录G所要求的试剂级别。6.2.1
应标签完整，并在有效期内使用。6.2.2
每瓶试剂在使用前目测应无异物异色。6.2.34
6.2.4应严格按规定的温度存放。6.3基本培养基母液的配制和保存6.3.1制作培养基前需先配制基本培养基母液，MS基本培养基母液配制比例参见附录H，其它基本培养基母液配制比例可参考本方法。6.3.2母液配制应用去离子水。
6.3.3母液保存要求：母液保存应置于4℃左右的冰箱内。母液保存期应不超过15天，6.3.4母液容器上应贴好标签，注明名称、配制日期，发现标签不明或母液中有沉淀、浑浊或变色现象应停止使用。
6.4植物生长物质的母液配制
6.4.1植物生长物质的母液配制浓度0.1mg/mL~1.0mg/mL，植物生长物质的母液配制方法参见附录I。
6.4.2植物生长物质的母液保存要求：母液配制好后贴好标签，按规定要求保存，保存期应不超过2个月。
6.5培养基制作
6.5.1准备：根据培养基成分准备好去离子水、琼脂、蔗糖和各类母液等。6.5.2琼脂融化：加去离子水700mL（按所需容量的70%左右），再加入琼脂5g～9g，加热搅拌使琼脂融化。
6.5.3糖溶解：琼脂融化后，加入蔗糖30g，稍加热使糖溶解。6.5.4加母液：糖溶解后，按附录F吸取母液，即依次加入A大量元素50mL/L、B铁盐10mL/L、C微量元素5mL/L、D有机成分5mL/L、E有机成分10mL/L：再根据要求加入激素（不耐高温的激素，应在培养基高压灭菌后再过滤灭菌加入）若干，并充分搅拌。6.5.5定容：搅拌均勾后，加去离子水至1升。6.5.6pH值测定：充分搅拌后，用pH计或pH试纸测pH值，用0.1mol/L的HCI或0.1mol/L的NaOH调节pH至要求值，一般为5.8。
6.5.7分装：根据不同需要定量分装，如250mL的培养瓶，每升分装25瓶～30瓶，每瓶分装约33mL~40mL。分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。6.5.8封口：盖好瓶盖，或用封口膜封口，扎绳需紧。3
各类标准行业资料免费下载DB33/T752—2009
6.5.9灭菌：分装后应按照7.1的要求，在10h内进行高压灭菌。6.5.10冷却：灭菌后的培养基应冷却，待完全凝固后再用。6.5.11贮存：灭菌后的培养基应注明培养基编号及配制日期。按培养基种类和配制先后分门别类储存于培养基储藏室内。为保证培养基质量，宜将配制好的培养基放置5天左右再用，且贮存时间不应超过一个月。
注：6.5.1~6.5.11为配制1升MS培养基的方法，配制其它不同容量MS培养基的方法可参考本方法。7消毒灭菌操作
7.1湿热灭菌
7.1.1组培中主要采用高压蒸汽灭菌器进行湿热灭菌，高压灭菌器适用于培养基（不耐高温的成分除外）、无菌水、玻器皿、金属器械等，以及污染瓶的灭菌处理。7.1.2应严格按使用说明书操作各种类型的高压灭菌器。7.1.3灭菌要求：一般1.1kg/cm2~1.2kg/cm2下，121℃灭菌20min~30min。7.1.4已灭菌的培养瓶或物品不得与未灭菌培养瓶或物品混放；合格的灭菌培养瓶或物品，应注明灭菌日期，合格标志。
7.2干热灭菌
7.2.1玻璃器皿及耐热器械应采用干热灭菌。7.2.2干热灭菌利用烘箱加热到160℃～180℃的温度来杀死微生物，通常170℃持续90min进行灭菌。
7.3过滤灭菌
7.3.1不耐热的物质需采用过滤灭菌，一些植物激素（如赤霉素、玉米素、脱落酸等）和一些抗生素类通常采用过滤灭菌方法
7.3.2过滤灭菌采用滤膜网孔直径为0.45um以下的微孔过滤灭菌器，7.4灼烧灭菌
7.4.1用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌。7.4.2灼烧灭菌可采用接种用电热灭菌器或用酒精灯灼烧灭菌。7.5擦拭、喷雾灭菌
7.5.1物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等。7.5.2擦拭、喷雾灭菌可用75%的酒精或0.1%的新洁尔灭菌。7.6紫外线灭菌
7.6.1在接种室、培养室等房间定期用紫外灯灭菌。7.6.2紫外灯灭菌一般为30min。7.7熏蒸灭菌
7.7.1接种室和培养室定期(一般1年1次～2次)用高锰酸钾及甲醛混合熏蒸。7.7.2熏蒸时，房间关闭紧密，用甲醛（10mL／m）和高锰酸钾（KMnO4，5g/m）熏蒸2d～3d，通风无味后（一般需2d～3d）人员方可进入。7.8表面灭菌
组培中的外植体需进行表面灭菌，参见第8章。8培养材料和外植体灭菌
8.1培养材料的选择
从具有品种典型性状的健康植株上选择芽、茎或、种子、鳞茎、花梗、根等植物材料作为外植体。8.2外植体的采集时间
于晴天或露水干后采集外植体。4
各类标准行业资料免费下载8.3外植体灭菌
DB33/T752—2009
8.3.1无菌水的准备：将自来水加入有盖的培养瓶中，按7.1的要求进行高压灭菌。8.3.2材料预处理：种子预先浸种0.5h至数小时：植物材料除去老叶，剪取所需幼芽茎段（2cm～3cm长）、叶片（适当大小）、花梗（约5cm长）、鳞茎、根（约5cm长）等。整理好的外植体，用中性洗衣粉加少许吐温浸泡并振荡5min～10min，自来水冲洗30min60min。8.3.3在超净台上将预处理后的外植体放在有盖容器中，倒入75%酒精使之没过外植体，并轻摇以除去气泡，经过10s～50s，将酒精倾去，用无菌水冲洗外植体3遍。8.3.4芽、茎段、叶片及花梗等的灭菌：用0.5%～2.0%的次氯酸钠溶液浸泡10min～15min，处理过程中要不断轻摇，将外植体表面的气泡除去，灭菌结束后，倒出灭菌液，用无菌水冲洗3遍5遍后备用。免费标准bzxz.net
8.3.5根、鳞茎等的灭菌：用1.0%～2.0%的次氯酸钠溶液浸泡10min～15min，处理过程中要不断轻摇，将外植体表面的气泡除去，灭菌结束后，倒出灭菌液，用无菌水冲洗3遍～5遍后备用。8.3.6果实和种子的灭菌：果实用1.0%～2.0%的次氯酸钠溶液浸泡15min，无菌水冲洗2遍～3遍后接种果实内的种子或组织；种子用1.0%～2.0%的次氯酸钠溶液浸泡20min～30min，处理过程中要不断轻摇，将外植体表面的气泡除去，灭菌结束后，倒出灭菌液，用无菌水冲洗3遍～5遍后备用。8.4升汞的配制和安全使用
使用条件：配备专用的有害液体处理池的单位可使用升汞进行外植体的表面灭菌处理。8.4.1
8.4.2升汞溶液的配制浓度和保存：升汞溶液的配制浓度为0.1%。溶液装在棕色玻璃瓶中贮存。8.4.3灭菌时间：0.1%升汞溶液灭菌10min15min。8.4.4安全管理方法：升汞安全管理方法参见《浙江省医疗用毒性药品经营管理办法（试行）》9接种操作
9.1操作准备
9.1.1接种人员应在更衣室更换拖鞋、穿白大褂（或接种服），戴上帽、口罩后进入接种室（或经过风淋室后进入接种室）。
9.1.2接种人员在接种之前应准备酒精灯或电热灭菌器、酒精或新洁尔灭、无菌脱脂棉或纱布以及接种器械、培养基、接种用苗等。9.1.3超净工作台（或洁净无菌接种室）提前30min开机通风，同时打开操作间、更衣间及缓冲间的紫外灯，一般灭杀菌30min后，关掉紫外灯：关紫外线灯15min～20min后人员才可进入室内。9.1.4超净工作台消毒：用75%酒精或0.1%新洁尔灭仔细擦一遍。9.1.5提前15min打开接种用电热灭菌器。9.1.6操作人员洗手后，用75%酒精喷手于操作台内吹干，勿双手互擦9.2提取母瓶
9.2.1母瓶检查：提取母瓶时要仔细检查母瓶是否污染，若发现污染母瓶应立即剔除。9.2.2母瓶预处理：按生产计划提取母瓶，表面喷75%的酒精后，用无菌纱布擦净，放于操作台旁备用，接种过程中若发现母瓶污染则立即封口。9.2.3污染母瓶处理：把污染母瓶放于统一地点供集中处理。9.3切割碟子的取放
用无菌镀子从棉布包里取出碟子放在超净工作台面上，应注意手不能接触碟子的边沿。9.4接种器械灭菌
9.4.1接种前接种器械用棉布或纸包好按7.1的要求进行高压灭菌。9.4.2接种时若使用酒精灯灭菌，从布包里取出接种器械，先用75%酒精擦拭，再放在酒精灯外焰上灼烤一遍，要求接种器械在火焰上灼烤时间在10s以上。n
各类标准行业资料免费下载DB33/T752—2009
9.4.3若使用接种用电热灭菌器，从布包里取出接种器械，先用75%酒精擦拭，再插入接种用电热灭菌器中进行灭菌，150℃～250℃灭菌30s以上。9.5接种
9.5.1在接种之前，工作人员的手部，包括手腕，都要用75%的酒精仔细擦拭一遍。9.5.2接种器械按9.4.2或9.4.3方法灭菌后，在器具搁置架上晾放2min以上备用。9.5.3取苗：先打开培养瓶盖，瓶口不要斜向外，取出的苗放于无菌的碟子上分苗；一次取苗不宜太多，以免风干。
9.5.4切苗：碟子放在离风窗10cm～20cm处；在操作过程中，手术刀和镊子都要在无菌碟子斜上方操作，不应在其正上方操作：切苗过程中产生的废弃物可堆放在无菌的碟子内的一侧，不应散到碟子外。9.5.5接苗：打开培养瓶盖，瓶盖朝下放置在无菌的碟子上，碟子应经常用75%酒精纱布涂抹灭菌：接苗时，镊子不应碰到培养瓶外壁或瓶口。9.5.6一瓶内一般不宜接种得太多，数量因种而异。250mL的培养瓶的一般增殖培养接种数量为5株/瓶或5团/瓶，生根培养接种数量为10株/瓶。9.5.7组培苗在瓶内要排放均匀、整齐；接种深度以组培苗不倒为准。9.5.8接种器械清洗和灭菌：切割和接种后，接种器械在盛有75%酒精的瓶中将接种器械上的琼脂和碎叶或碎根漂洗掉；或接种器械用75%酒精浸湿的纱布擦净；按9.4.2或9.4.3方法灭菌后晾放备用。9.6封口
及时盖上瓶盖，其松紧度以用手转不动为准。9.7记录
接种人员将品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期认真标示到瓶上：逐日统计本人的接种数量，包括接种前瓶数和接种后瓶数，字迹工整。9.8送苗
接种完毕，把瓶苗送到培养室，宜整齐摆放在指定的组培架上。9.9关机
离开之前应熄灭酒精灯或关闭电热灭菌器，把超净工作台收拾干净，清理接种过程中产生的空瓶、垃圾及杂物，擦拭操作台面，并用75%酒精喷洒台面，台上的物品也宜摆放整齐；最后关闭超净工作台及电源。
9.10组培接种人员的注意事项
操作人员应注意个人整洁，勤剪指甲，操作时头、略膊等不应进入超净工作台内。9.10.1
9.10.2操作时不应随意谈话、说笑，以减少污染。9.10.3工作人员出入应随手关门。9.10.4工作过程中所产生的垃圾应及时清理。9.11接种操作的安全管理
子、解剖刀、手术剪等接种器械的灭菌采用酒精擦拭或浸泡后在酒精灯上烧烤的方法进行，接种器械烧烤时应远离盛酒精的容器，不应烧烤后立即插入盛酒精的容器中，也应避免碰倒酒精容器或酒精灯后引起失火。在酒精灯点燃后，不可用酒精落液喷酒超净工作台。方一失火，应立刻关闭电源，用湿布扑灭；若火势较大，用灭火器扑灭。10培养室操作
10.1培养室培养条件调控
培养室的温度一般控制在25℃±2℃，相对湿度70%～80%，光照强度18.75μmolm2-s～37.5μmolms\（1500lx～3000Ix），以每天12h～16h为宜，每天早上、中午、下午各检查一次并做好记录。
10.2瓶苗摆放
各类标准行业资料免费下载培养室内，瓶苗宜摆放整齐，品种应分明。10.3污染检查
10.3.1接种材料污染采取培养室管理员和接种员双重鉴别制，各自做好记录。10.3.2所有污染材料不应在培养室、接种室及中央走廊内开启瓶盖。10.3.3所有污染材料（包括真菌和细菌污染）应在发现当天送到洗涤室。10.3.4对细菌污染的生根瓶苗可转移到练苗室移栽。10.3.5对处理情况进行数据记录和简要分析原因，并反馈给操作人员。10.4工作人员注意事项
10.4.1进入培养室应穿工作服，包括更换拖鞋、穿白大褂。在培养室内保持安静。
进出培养室时应及时关门。
各种生产用品要按固定的位置排放整齐。工作过程中所产生的垃圾应及时清理。DB33/T752—2009
培养室内出苗、进苗后，应及时整理，保持室内清洁，每天用自来水拖1次2次地面。10.4.6
设备维护：维护各种生产设备的正常使用，不正常应及时告知后勤保障部进行处理。10.5培养室内清洁、消毒
每周用75%的酒精溶液作喷雾降尘处理。每周用消毒液（0.1%新洁尔灭）抹地板、门窗等。每隔一周用紫外灯或臭氧发生器消毒30min如培养室有通风装置（如安装有换气扇等）的可用甲醛熏蒸，每年1次～2次。10.5.54
每月用杀螨剂（克螨特、阿维菌素）、杀虫剂（吡虫啉、艾克敌）、杀蚂蚁药等药剂喷雾一次。定期检查培养室内漏雨及墙壁长霉情况，发现有霉菌时应及时去除，并用防菌涂料粉刷墙壁。10.5.6
按10.5.1、10.5.2方法处理时培养室内可以保留培养材料；按10.5.3、10.5.4、10.5.5、10.5.610.5.7
方法处理时培养室内应清空培养材料，进行空室处理。组培苗移栽和组培穴盘苗生产
11.1练苗
11.1.1移裁标准：一般生根培养20d30d后，幼苗基部长出3条以上、长1cm~3cm的新根。11.1.2在移栽前将培养瓶放置温室自然散射光下，温度控制在25℃土3℃，封口炼苗3d7d。11.2移栽
11.2.1出瓶：用手指或镊子轻轻取出组培苗，放入清水内（注意水温勿相差大、冬季水温应调整为20℃～25℃）。洗去琼脂、分级待移栽。11.2.2配制混合基质：配制混合基质泥碳土：珍珠岩：蛭石按一定比例混配好（一般比例为3：1：1，宜根据不同植物加以适当调整），装入穴盘中并压紧，定植前用0.5g/L的多菌灵溶液浸透11.2.3定植：用竹签等工具在每穴上打能容纳根系的孔，将组培苗的根系放入孔内，覆土压实。11.2.4摆放：分品种、日期，归类整齐摆放。11.3管理
11.3.1温度：根据植物生长习性确定移栽时的控制温度，适宜温度为15℃～28℃。11.3.2相对湿度：移裁2周~3周内用薄膜小拱棚保湿，相对湿度控制在80%100%，在大棚相对湿度高于80%期性时，薄膜小拱棚可适时通风0.5h1h：当第一片新叶完全张开后，逐渐打开薄膜小拱棚以降低湿度，8周～10周后完全打开薄膜小拱棚，大棚相对湿度保持在60%以上。11.3.3光照：移栽4周内，薄膜拱棚内的光照强度控制在90umolm.sl～180μmolms（50001x~100001x），4周后逐渐增大光照强度。11.3.4浇水：4周后可用喷淋浇水。7
各类标准行业资料免费下载
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。