【商检行业标准(SN)】 出入境口岸军团菌检验规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2351—2009
出入境口岸军团菌检验规程
Examination codes of legionellaatfrontierport2009-07-07发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-01-16实施
本标准的附录B为规范性附录，附录A、附录C、附录D为资料性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2351—2009
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：朱玉兰、吴兵、高朝贤、朱海、杨泽、叶健忠、古莉冰、刘志明本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I
http：//foodmate.net1范围
出入境口岸军团菌检验规程
SN/T2351—2009
本标准规定了出人境口岸军团菌检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及阳性结果判定、处置。本标准适用于出人境口岸军团菌的检验。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是未注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB19489实验室生物安全通用要求WS195军团病诊断标准及处理原则3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
军团病legionnarires'disease，LD军团菌属（主要是军团菌）引起的细菌性呼吸道传染病，临床表现有两种类型：非肺炎型和肺炎型3.2
军团菌legionella
引起军团病的病原菌，系兼性细胞内寄生的革兰阴性杆菌，军团菌是人军团病的主要致病菌。4实验室生物安全防护
实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备及个体防护应符合GB19489中二级生物安全防护实验室的要求。
5对象
5.1疑似感染军团菌的出入境人员。5.2环境污染标本。
6准备
6.1检验试剂
6.1.1细菌培养鉴定及聚合酶链反应（PCR)试剂的制备参见附录A，或购买符合要求的商品化检测试剂盒。
6.1.2直接荧光抗体染色（DFA）、血清学检验及尿抗原检测见WS195或购买符合要求的商品化试剂。
6.2仪器设备
仪器设备参见附录A。
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SN/T2351—2009
7标本的采集和处理
7.1疑似感染者标本的采集
7.1.1发病期患者的痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织可进行病原学检测，常规采样后立即送检，采样过程中应使用无菌蒸馏水。7.1.2无菌方法采集发病期患者胸水，用有盖无菌试管保存，立即送检。7.1.3用于培养的尿液标本采样前应清洗并消毒患者尿道口，留取中段尿10mL~20mL于无菌容器中，立即送检。用于尿抗原检测的标本可常规留取中段尿。7.1.4用不抗凝的真空管采集并保存患者急性期（发病3d内）、第3周、第6周血清用于血清学检测。7.2疑似感染者标本的处理
7.2.1肺组织用蒸馏水在无菌条件下制成悬液，痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液、肺组织悬液经酸处理或热处理后进行培养（见7.5）。7.2.2无菌方法采集的胸水、消毒尿道口留取的中段尿、血液等正常情况下无菌的标本无需处理直接用于培养。
7.2.3血清学试验的血液采集后室温放置1h后，3000r/min离心5min，分离出血清7.3环境污染标本采集
水样用无菌容器采集200mL～500mL，尘土和泥土用无菌蒸馏水制成悬液。水样中如果含有含氯或其他氧化剂，应在取样时或取样前加人硫代硫酸钾或相应的非活性试剂中和。从样品采集、浓缩到送检间隔不超过2d，实验室接到水样后应尽快进行微生物学分析。7.4环境污染标本处理
7.4.1膜过滤法
采用膜过滤装置进行膜过滤，采用直径47mm~147mm，孔径0.22um的膜。过滤后的膜应放置在带盖的无菌容器中，可用无菌剪刀剪碎，加15mL的无菌稀释液或无菌蒸馏水，不断摇动至少2min。也可将容器放入超声波中10min。7.4.2离心法
取200mL样品于300mL~500mL容积的离心瓶中，6000r/min离心10min或3000r/min离心30min保持温度在15℃～25℃，弃去上清液，将沉淀物悬浮在15mL无菌蒸馏水中。7.5酸处理和热处理
7.5.1处理目的
为减少痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等正常情况有菌的标本和环境污染标本中的杂菌生长，标本需进行酸处理或热处理。同一容器内的标本只能选择酸处理或热处理中的一项，两种处理方法不能重复。
7.5.2酸处理
取患者痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等标本2mL，转移至有盖无菌试管中。取经7.4处理过的环境污染标本10mL，转移至有盖无菌试管中，3000r/min离心30min，用无菌枪头吸去8mL体积的上清液，通过涡旋重新悬浮剩余物。每个装有2mL标本的有盖无菌试管中加人8mLpH2.0酸性缓冲液.混匀，室温静置10min。加人碱中和试剂.调至未加酸性缓冲液时的pH值，静置10min.待查。
7.5.3热处理
取患者痰液、纤支镜毛刷标本、支气管灌洗液和肺组织悬液等临床标本或环境污染标本2mL，转移至有盖无菌容器中50℃士1℃水浴处理30min士2min。2
品伙伴欧
8实验室检验方法
8.1细菌培养鉴定，见附录B
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8.2尿液中抗原的检测，采用免疫层析法，按照相应商品化试剂说明书（以美国Binax公司NOW试剂为例），参见附录C。
8.3聚合酶链反应(PCR)检测，参见附录D。8.4直接荧光抗体染色按照WS1958.5血清学检测按照WS195或按照商品化试剂说明书。注：其他符合检测要求的商品化试剂盒，在验证合格后均可参照使用，本标准不做推荐。9结果判定与报告
9.1细菌培养鉴定报告
9.1.1标本中培养出军团菌，报告“细菌培养检出军团菌”。9.1.2BCYEα培养基或GVPC培养基14d内未见可疑菌落，报告细菌培养14d，未检出军团菌”。9.2尿抗原检测报告
9.2.1尿抗原检测阳性，报告“尿军团菌抗原阳性”。9.2.2
尿抗原检测阴性，报告“尿军团菌抗原阴性”。9.3PCR检验报告
9.3.1PCR检测阳性，报告“军团菌PCR检测阳性”。PCR检测阴性，报告\军团菌PCR检测阴性”。9.3.2
9.4血清学试验报告
9.4.1血清学试验阳性，报告“军团菌抗体阳性”。9.4.2
血清学试验阴性，报告“车团菌抗体阴性”。10阳性结果的处置
10.1细菌分离培养阳性的菌株应传代保存.疫情报告上级主管部门.同时向当地卫生行政主管部门及疾病预防控制中心通报。
10.2血清学检测、尿抗原检测结果阳性或可疑阳性的标本，宜选择直接免疫荧光抗体染色及细菌分离培养和PCR方法进行复检验证。
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A.1主要试剂
附录A
（资料性附录）
军团菌检验主要试剂及器材
A.1.1培养基的主要成分及制备方法A.1.1.1BCYEα培养基配方
N-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸（ACES酵母浸膏（细菌学级）
可溶性焦磷酸铁
活性炭
L-半胱氨酸
氢氧化钾（分析纯）
α-酮戊二酸一钾盐
蒸馏水
A.1.1.2BCYEα培养基制备方法
1000mL
将ACES加到含900mL蒸馏水的烧瓶中，置50℃水浴约1h，直到ACES完全溶解。将干燥的活性炭、酵母浸膏、琼脂和α-酮戊二酸加人溶液中，充分混合。再加人80mL蒸馏水，121℃高压灭菌15min，取出后，放50℃～55℃水浴中保温。将L-半胱氨酸、焦磷酸铁分别溶于10mL蒸馏水中，并用0.22μm孔径的滤菌器过滤除菌.加入上述液体中，充分混匀。用1molKOH调整pH至6.90。A.1.1.3BCYE-Cys培养基
BCYEα培养基配方去掉L-半胱氨酸，按A，1.1.2方法制备。A.1.1.4GVPC选择性培养基
按A.1.1.2方法制备，在加入L-半胱氨酸、焦磷酸铁后，每升另加入：甘氨酸
万古霉素
放线菌酮
多粘菌素B
A.1.1.5酸性缓冲液
A液：0.2mol/L氯化钾溶液（14.9g/L）B液：0.2mol/L盐酸（17.2mL/L)取18份A液和1份B液，混匀.pH为2.0。A.1.1.6碱中和试剂的配制
C液：0.1mol/L氢氧化钾溶液（6.46g/L）取C液10.7mL加89.3mL蒸馏水.pH为13.0A.1.2PCR试剂
10万U
A.1.2.1Tris-盐酸(pH8.8）.181.7g/LTris.浓盐酸调整pH值。A.1.2.2TE缓冲液：10mmol/LTris-盐酸(pH8.0).1mmol/LEDTA(pH8.0）)。A. 1.2.3
10XPCR缓冲液：500mmol/L氯化钾（KCl），40mmol/L氯化镁（MgCl2），100mmol/LTris-盐酸.pH8.5。
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SN/T2351—2009
A.1.2.4电泳缓冲液：242gTris碱.57.1mL冰乙酸.100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸馏水至1000mL，使用时10倍稀释，
A.1.2.520XSSC缓冲液：在800mL蒸馏水中溶解175.3g氯化钠（NaCI)和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值至7.0.加水定容至1L分装后高压灭菌。A.1.2.6琼脂糖（电泳级）
细菌培养器材
培养皿（70mm、90mm）；
蠕动泵；
滤膜滤器；
旋涡振荡器；
离心机；
光学显微镜：
解部副显微镜：
全排式生物安全柜；
-CO2恒温培养箱；
—0.22μm除菌滤膜；
高压蒸汽灭菌器：
玻璃吸管（2mL、5mL）、量筒（50mL、200mL）、三角烧瓶（200mL、1000mL）；电子天平秤（精确到0.01g)；
普通冰箱。
A.2.2PCR器材
离心机：
PCR仪：
电泳仪；
可调移液器：1μL~10μ、2~20μ、20μ～200μ、100μ~1000μ；一凝胶成像仪。
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SN/T2351—2009
B.1初培养
附录B
（规范性附录）
细菌培养鉴定
将酸处理或热处理的标本3000r/min离心10min，用无菌吸管吸弃上清液，保留1mL重新悬浮沉淀物，正常情况无菌的标本直接用于培养。用无菌吸管吸取沉淀物悬液或正常情况无菌的标本，分别滴加1滴～2滴在BCYEα军团菌专用培养基和GVPC选择性培养基上，划线接种或涂布接种。35℃，5%CO2培养箱中培养，连续观察3d～7d,军团菌在BCYEα培养基上的菌落通常呈现白色、灰色、蓝色、紫色，但也可能出现棕色、粉色、灰绿色或深红色。军团菌表面光滑，边缘整齐，出现典型的毛玻璃现象。发现上述菌落即为军团菌可疑菌落，进行下一步分离培养鉴定。无可疑菌落，培养顺延到14d，报告“细菌培养14天，未检出军团菌”。B.2分离培养
挑取初培养可疑菌落分别在BCYEα培养基和BCYE-Cys培养基或血平板上划线接种。35C，5%CO2培养箱中培养。观察2d～4d，在BCYEα培养基上见到菌落形成而BCYE-Cys或血平板上未见生长，即初步判定为军团菌.用军团菌诊断血清做分型试验进一步验证。聚合酶链反应（PCR）可辅助用于军团菌的鉴定，作为参考
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C.1原理
附录C
（资料性附录）
尿抗原检测
SN/T2351-—2009
Binax公司的NOW军团菌尿抗原检测试剂采用免抗军团菌1型抗体标记的免疫层析试验，用来检测尿液中可溶性军团菌1型抗原。C.2操作步骤
C.2.1将患者的尿液和检测试剂平衡到室温（15℃～30℃），从包装袋中取出检测设备C.2.2用Binax专用棉签蘸取待测尿液，并使之完全覆盖专用棉签。如果棉签上有尿液滴下，将棉签触到尿液容器的边上以移去多余尿液。C.2.3检测卡内部的右侧板上有2个孔，将蘸有尿样的棉签从底孔插人，慢慢向上，直到使棉签头部在顶部的孔中充分可见为止，不要移走棉签。C.2.4垂直握住试剂A瓶，离检测设备10mm~20mm的高度，垂直在底孔内滴入2滴试剂A。C.2.5立即拉开检测卡右测边缘上的粘条，合上检测卡，完全封住。15min后通过窗口读取结果。C.3
3结果判断
阴性结果：检测卡窗口上方出现一条紫色的对照线。阳性结果：检测卡窗口出现两条紫色的线。试剂无效：检测卡窗口看不到任何线条或只有样品检测线出现htt
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D.1扩增引物
附录D
（资料性附录）
聚合酶链反应检测
下列是根据军团菌基因设计的一对引物，具有高度特异性，供使用时参考。阳性标本可扩增出386bp的片段。
上游引物：5'AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3下游引物：5'CCAACAGCTAGTTGACATCG-3”D.2模板制备
D.2.1菌种的模板制备
D.2.1.1取实验菌株对数生长期菌落，稀释一定浓度（1×106CFU/mL），取10μL菌悬液，溶于90μLTE中。
加人溶菌酶（20g/L）10μL，37℃水浴30minD.2.1.2
加人SDS（10%）10μL，60℃水浴10min（变清为止），室温冷却。D.2.1.4
加人蛋白酶K（10g/L)10μL37℃60min。加人RNA酶（10g/L)10μL37℃30min。D.2.1.5
加人150uL酚-三氯甲烷-异戊醇混匀液，抽提3次。D.2. 1.6
加人冰乙醇，12000r/min离心10min，弃上水相.自然干燥，加人1×SSC100μL，4℃保存D.2. 1. 7
待测。
D.2.2临床标本的模板制备
D.2.2.1取血、胸水2mL.5000r/min.5min.弃上清液，加TE300μL。D.2.2.2100℃煮沸30min，室温冷却。D.2.2.3加人RNA酶（10g/L)10μL37℃30min。D.2.2.4离心12000r/min.5min，取上清10μL用于PCR扩增D.2.3环境污染标本的模板制备
标本按7.4处理并浓缩，浓缩后的标本按D.2.2处理。D.3扩增
D.3.1取无菌的0.2mLPCR扩增管，设置阴性对照、阳性对照，将样品编号，按照以下加样量加样：模板
10XPCR缓冲液（含氯化镁）bZxz.net
4dNTPs(1.25mmol/L)
上游引物（10μmol/L)
下游引物（10μmol/L）
Taq酶(5U/mL)
双蒸水
D.3.2混匀，6000r/min离心1min，将管内液体甩人管底。D.3.3设置扩增反应条件：94℃5min；94℃60s，61℃60s，72℃60s.35个循环；最后72℃5min，进行PCR扩增。
全品伙伴网
D.4电泳
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取10μL扩增产物，加人2μL溴酚蓝上样缓冲液，混匀，在1.5%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）加样，以5V/cm稳定电压电泳30min，用凝胶成像系统观察结果。D.5结果判定
如阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带（扩增片段大小为386bp），则可初步判定该样品军团菌PCR检验阳性，应进一步进行测序验证；如果待测样品中未出现PCR扩增产物.则可判断待测样品军团菌PCR检验阴性9
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中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
出入境口岸军团菌检验规程
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中国标准出版社出版
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电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张1字数16千字2009年11月第一版
：2009年11月第一次印刷
印数1—2000
书号：155066·2-19920定价18.00元//ww.foodmate.net
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