【商检行业标准(SN)】 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2344—2009
黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法Quarantine identification of cucumber green mottle mosaie virus2009-07-07发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-01-16实施
http：//foodmate.net十华人民共和国出人境持验检凌行业标滩
黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法SN/23442009
中国标准山驳社版
北京泵兴门外准河北街16号
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电话：6852304118517543
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数17千宁
2C09年10月第一版209 年10月第一次刷E 1—2 G3
→：136026·2-159 差价 16.00 元http://foodmate.net前言
本标的附录、录为规范性除录附录A、附录I)为资料性附录。本标准由耳家认证认可蓝暨管川委员会出并灯口：SN/T 2344—2009
本标准起单并位：中华人民共和国辰门出人境检鉴检疫同中华人民共和国北京出人竟检验检疫局、中国检验检设科学讲究院。中华人民共和国广四山人境俭验龄疫局本标滩主甚起草人：陈市、邓丛良、张水江廖宫荣、林明、陈红A、工东毅、李伟丰、李树庆本标准系百次发布的出人魔检验检疫行心标准1
http://foodmate.net1范围
黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法本标雅规定盏瓜绿斑驳花川病南俭疫鉴定的基本原则和方法，SN/T 2344—2009
衣怀雅适用下川能带有英瓜绿斑骏花川病的劫产科作物的种子和节末的给疫鉴是。？原理
2.1黄瓜绿斑驳花叶病毒学名与分类地位学名.Cucumhe: grecn rotle rirsaic vrus缩.CGMMV
分类地位：烟草花叶病毒唇（Tmunnirus)成员2.？血清学特性
tGMMVH方很强的免疫原性：
2.3粒体形态
黄低绿斑驳帮病毒粒体为直杆状，长度为3cmm.宽为18 mm2.4：基因组
病患甚基因红为正单链kNA,全长约 6.1kb,编码1 个蛋H;病甚基固纽 5 和 3 端分别个有一段非编码区
该病球寄主范而广泛、行严虽，相关资料参州除求A，3主要议器设备与试剂
3.1主要仪器设备和用具
镀员到磨仪：
透射电了亚微镜；
搏标仪：
洗板机；
摄量天（量：0.001%）：
PCR仪：
电泳仪：
乎山球
凝疫成像仪：
高速冷冻台式肉心机：
水浴槽：
pH计;
各种量的可调移液带（10r0 ,2g,2℃,2）各种吸头( 00μ,20℃p,20μ2p1：6孔博标极：
离心管(1. 5 ml.,C. 5 ml.2 ml)3.2主要试剂
主试剂和缓冲液见附录13和附录（,1
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SN/T 2344—2009
4检测样品的制备
4.1种子样品制备及检疫鉴定
跳取0粒种了正点跳取崎形、不驳熟的种了播十火菌十中,得长出3片1片叶片将表现症状的相株编号，末表现症状梢殊分纠（1榜为1到纠)并编号，采集的口升分驳3份，根据需要分别用于酶联测定负疫和分子生物学途测及且子显缴观察，也可以挑暇略形，不战熟的种子凸接逆行避埃测定却分子生物学检测4.2雷木检验鉴定
有症妆的由不中别检测。激令症状的办组检测：分组方法利检测方法同4.14.3植物产品的检验鉴定
猎物产品有拓状的部分（如，果实上的峰形、斑驳等)单独检测：没有症状或无法观察症状的消物产品：应按比例取栏.检测方法为酶联测烂和分子牛物学检测，5检测与鉴定
5.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加人已包被（GMMV抗体的96孔悔送板中·过行[ASEL1SA检测，每个详站平行加到两个孔中，设阴性对照和阻性对照，栏品提取缓冲液作空对点：H中阴性对照种类和对料(如种于戎叶片)应尽虽与拾测样品一致。其体染作见际录B.
5.2 RT-PCR 检测
分别提取样品和对的总RNA，反转录介成cDNA后·进行TCR扩增，设阴H对照·感染CGMMV的梢物纽织作阻件对照.用趋纯水作空白对照。体操忙见附录［5.3免疫电子显微镜观察
H体作参见录[
6 结果判定与记录
第5 章检测与鉴定中如呆2种方汰俭测为结果为:性:即判断该种节携术黄瓜绿斑聚驳花Ⅲ病。恃联测定为性店,RTPR险测为引性即川判断为携带有黄瓜绿斑驳花叫病。必安时川逊行哟接种试验：并进行衰验
7结果记录与样品保存
7.1结果记录
完整的实验记录也括：样品的束誠、种类、时间：实验的时、比点、方法和结界等，产安有经于人和实验人员的等学。电镜观察需有病毒粒体照片：酶联测定需有酶联板反应的照片知原始数据；PR检测带右心淤蒲果照片，
7.2样品保存
鉴下声瓜绿斑驳花叶病南为检疫性有害生物·病有活体样品存在，上他实验样品应双善供宁丁s0冰箱中
http://foodmate.netA.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
黄瓜绿斑驳花叶病毒相关资料
SN/T2344—200g
黄瓜绿斑驳花病在广然界主县俊染四瓜（Cirrulluslanatts）甜瓜（etueuntmelo）、黄瓜（nswmis sutious)南a(Cucurbte nuschaia), flagenria sicraria), a(Luffa cylineirica)苦JR(Momcreica churanmia)等芦科拉物。此杂草也是CGMMV的省：北美宠（Anarumhus tti-tode尺枝花Amarnnthsrerroferus大齐菜?lioopinmerooaeum，l齿nPatufaeaoeacea）.龙葵（alanumnigrum），A. 2病害症状
黄低，叫序并凸起,崎形,相株矮化,果实「可产牛黄或银色条斑,果实严亚受损西瓜：受侵染口-片轻型叫斑驳.严亚时出现斑，挡株矮化，成熟朗果实表前出现浓绿色圆斑，果肉变色和腾烂
甜瓜，紫端将旧山既茎斑·随川片老化症状减轻。轰了;叶出现花叶;有绿仁冤题,尿间黄化,叶尿早绿带状。A.3分布地区
GMMV丁1S35什在英国的黄瓜上被发现和道，Ⅱ前在英国、希片、罗马尼亚例牙利、印度、沙将阿拉、丹髪，德国、俄罗斯、课而利业、捷克、巴四、爱尔兰、呼尔多瓦、瑞典、芬兰、国、朝藓、以色列波兰、日木、巴属期坦和我国大陆、台湾均有分布：A.4传播途径
MMV叫以迫过接触传播，也叫以逆过种子传播·凹瓜学逆过带的站木懿子而感染，常州,瓜类病毒的传摘介体蚜业不能传摘GMMV,嫁接等农市操性也足出问病流行的主安国素：注株一口发疾，如某木进行杀灭处Ⅲ;土壤也毒：带毒土壤也叫以成为病害发牛的侵染源http：//foodmate.netSV/T 2344—2009
B.1试材
B. 1. 1 包被抗体
附录B
(规范性附录)
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
特兄性的黄瓜绿斑驳花川病胰就体，13.1.2酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的黄派绿斑较花叶病毒抗体B. 1. 3 底物
对硝基举磷液一钠（P）
B. 1. 4样品抽提缓冲液(PH7. 4)PI3ST
业流酸钠（NaS()）
PVP(MW24 CU-- 10 300)
替氮化钠Na）
1℃储存
B. 1. 5 包被缓冲液(pH9. 6)
酸酸销（(Na）
酸氧钠(NaHO）
叠氮化（NaN：
灿入蒸诏水 900 mL 水率解;用盐酸调节pH位到 9..然后蒸馏水至1 L:4（.储存,13. 1. 6PBST 缓冲液(洗涤缓冲液 PII7. 4)氢化纳(NaCI)
磷氮一钠HPO）
一氛钾（KIP）
氯化(KCI）
吐流-20
圳人蒸僧水 90 mL求率经,用NaOH战HC 调节H到7,然后小蒸馏水至1每Ps中人m的w2
13.1.7酶标抗体稀释缓冲液(pl17.4）PI3ST
133A(牛血清H蛋H)或脱脂奶
PVP(MW24 C0-- 40 900)
替氮化钠(Na）
B. 1.8底物(pNPP)缓冲液(pI9.8)氯化镁(MgCl)
氮化舶(Na）
乙驼胺
溶」8c mL.蒸僧水中:用酸调μH值至 9.8;热馏求定容至「I..4 ℃俯存。4
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B.2程序
H.2.1包被抗体
SN/T 2344—200g
用包被缓冲液将抗体安说明稀释，加人酶联假的孔中，μ孔，完，宰温恶育l或℃冰箱育过夜，清穴酶疾板引溶液，S二洗落4次一6次，B.2.2样品制备
待测详品按1：10车量：体积！加人油煤缓冲袋用讲体供满成浆，2/mn，离心l0min.上清液即为制备好的检测样品：阴性对照，阳性对照作相流的处理成按照说明[进行。13.2. 3加样
加人剖备好的检测样品、阴性对照、阳:性对照，100 I.孔·加盖，室温孵育2h或1“冰铲孵育过夜，清空酶联极孔中溶皴,BST洗疼4次~次。B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稠释至.性浓度：并圳入到酶联板中，10孔·州盖：宰温孵育2h,消牢蕲披孔中溶液,IEST洗涤4 次~-5次13.2.5加底物
将底物(PP加人到底物缓冲液中镜终浓度为1mrl(晚配既用),按1尔1./孔剂人到楞联极中,室温诬光育bZxz.net
13.2. 6读数
醇联仪在405nm处读（D值
13. 3结果判断
B.3.1对照孔的OD.-值(缓汁液孔、限机对照及阳性对照孔）,应该在质控制范固内·即缓冲孔和阳性对照孔的（01)4值0.15当阴性对孔的（01)4r-位0,C5H时，按 05引算阻件对照右明显的额色反应：性对照（儿4值/阴性对照（儿)：值2孔的复件基本一致。13.3.2在满处了B.3.1质量婴求后，结果原则「川判断如下：样（D值阴性对1位2.判为性
样品（D值/即性对照（OT)%估在网值近，判为可题弃品，需平等做一次，或他方法验证，样品（值/阴性对照D值2，划为限B.3.3若满是不『..1质量要求，则不能法行结果判断：5
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c.1 试剂
C.1.1RN4提取试剂
附录C
(规范性附录)
T-PCR 检测
rizl裂解液。氯中螃、兄内醇、%.婷。C.1.2反转录试剂
M-MLV RT(20 U/L),ERT 线冲液.dVTP(10 mmol/L),RNasin(4O U/rL).DEPC 处甲过的 dedH.O
C. 1. 3 PCR 试剂
10×PCR缓冲波、氢化镁（25mmol/1.)dNTP(10mmo/L)、Tag嗨（5U/ul)。C.1.4电泳试剂
C. 1, 4. 1 50 ×TAF
冰乙酸
N.EDTA -2H.O
32. 1 ml.
加水1L。用吋加水稀释1AE
C.1.4.26×加样缓冲液
.5深说龄监
为（质吴浓度)燕水溶液
. 2 实验步骤
C.2. 1 总 RNA 提取
称取0.1岛精物红织液氮磨成粉状出退将其移人灾周的1. 5ml. 离心管中,可人1 m1. 的Triz0l.试剂.刷烈振荡塔勾,室温萨置3 m:n:4%:12000g离心10 min,最上清液：加人200 μl.二氯巾饶，上下颠倒勾·室温静止3min:4（，12 co9g离心10 min,取上层水相;加芒休积的元丙信，颠倒混与;4,12 000g离心1C nmm:弃1清波：圳1ml.7的乙驼洗涤沉淀,4 ,7 00g离心mi,弃乙醇：沉」窄湿下充分「燥后·溶」3μL经I)EI\C(焦碳酸乙酯)处埋的ldH,O：一20 保存备用。C. 2. 2 RT-PCR 反应
C. 2. 2. 1 引物序列
上游引物 CGMMVI: GyggTAAgCgytA\CAAACCC 3*F裤引I物 GGMMV2:* CCAAACCAAIYAgCAAACCg 8R=-PCR产物人小654 bp
C.2.2.2 NA合成
反转录总体系为12.E#L，在 PCR管中依次加人3L总 RNA;1rL CGMMV2引物.在 65 温浴7 min,然后.冰浴 5 rin·瞬离,向 PCR 管中加人下列试剂:M Ml.V RT(200 U/uI)C. 5 μl5xRT缓冲液 2. 5 μl,dNTP(10 mmol/L)C. 5 μl,RNasn(10 L/pl). 5 μl,DEPC 处理的 ddI,O4.5ml，反应参数.3760min,9510min，个成的cDNA于一20冰效保存各用C. 2.2. 3 PCR 扩增
PtR反度体系光表1，反府参数:9；4min:3s,6 .72C0.0个循环：httn://
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72Cmin：也可来币一少法RTCR试剂进行扩增。表.1CR反应体系
试刻名称
uPCR缓冲液
紫北（2mmol/L)
ANTPC1C m?al/1.)
CX:MMV1t20 3:0l/ul)
CGMMV2+20 ol/ul)
To 酶 /μ;
JWA模坂
C.2.3琼脂糖电泳
C.2.3.1制备凝胶
加模显L
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补尼反成总体科尘
将1×一AE和良法级琼脂粘按1.0%（质量浓度)配好，在微被炉中熔化混勾：冷即至（左右.2.3.2加溴化乙锭)
加人澳化乙锭浓度为0.5/，勾，倒人已封好约避胶平台1，插1栏品梳，待暴校凝后，从制平台1除封带，发出梳了，加人足够量的TAE（缓冲液没过凝胶表内约1Im）C.2.3.3加样
用适量（约2叫3的6样缓冲液马81.样品混个：然后将H和合的1VA分子早标准物分别加人到琼脂糖凝胶孔中。C.2.3.4电泳
接逛电源使IDNA向极移动：当加卒缓冲液中的流酚盐迁移牟足够分离TVA片段时·关闭电源。将整个疫丁紫外透射仪上察。.2.4结果判断
阳性对照在4左处有增片段.性刘照和空对照无特异性扩增，如果样品山现与沿性对照，效的扩增条带，可判为性；如果样品末出现与H性对照效的扩增条与，判定结果为闯性，http：//foodmate.netS/T 23442009
D.1试剂
附录}
（资料性附录）
免疫电子显微镜观察
D. 1. 1 6.t5 mol/1. 的磷酸缓冲液(pH7. 0)D.1.2E ImImol/L IIECA(二之基二硫代氨基中酸钠、迅称铜试剂）D.1.30.5PEG 60r0
D.2实验步骤
D.2.1Formyar膜制作
将聚乙烯驼缩中醛(Fnrr:-r)溶」一甲烷,配成.2与~C.3杀液,贮」冰箱内备用：剂膜时取块干净玻璃片插人溶液小,最出倾斜待溶液率发,用锋利的力片沿玻璃力则娘，再将殿璃片以45缓慢循人蒸水中倬薄膜从殿开1悦整下来漂浮于水向，将新的、期格为23口的铜网小心摆！再甲一块滤纸覆盖H上，游起后暨于培亲血中」燥备用，D.2.2电镜样品制备
D.2.2.1样品的制备
取嫩的获什 m; m左的金例砂，. c 的PB缓冲液（含5 minol/L二硫苏糖信或β巯基乙信,5mmol/1.IFCA.0.5%PG 6300.调pI7.9)3.32ml充分耐磨.37 育2h后·室温6 000g 离心2 rain·上清液留作电镜制片而,D.2.2.？诱捕
将-滴120) 称释的（MMV抗血清首」石蜡板「,用表亚覆盖有 Forr:v~膜的到网放在「:面室活孵育10iI后，用滤红将钱网吸干，蒸馅水洗铜网，吸于：然片放在刺备灯的雄品「分制育15mi、2in、6）nn.吋用木经而消孵自的铜网作对照，用滤纸将编网吸于，蒸解水流网，再圾」。
D.2.2.3负染
出1-~2磷鸽酸负染2inir-3inir，晾十片即在透射电缆下观繁D.3结果判断
和末经抗血清孵育的铜网相比，诱拖的网在相间的视野下，观套创数呆较多的长度为30nm，充为18 mm的白杆状独毒粒体,则结尽是阳性5号 :155066 - 2-10936
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