【商检行业标准(SN)】 青椒中专基因成分定性PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2271—2009
青椒中转基因成分定性PCR检测方法Method of the ploymerase chain reaction for detecting genetically modifiedcomponents in pimiento
2009-02-20发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2009-09-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
青椒中转基因成分定性PCR检测方法SN/T2271-2009
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×1230www.bzxz.net
2009年5月第一版
印张0.5
字数9千字
2009年5月第一次印刷
印数1-2000
书号：155066·2-19658
定价14.00元
http：//foodmate.net前言
本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高宏伟、梁成珠、刘心同、王岩、于立欣、曹忠雷本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准http：//foodmate.netSN/T2271—2009
1范围
青椒中转基因成分定性PCR检测方法SN/T2271—2009
本标准规定了转基因青椒中外源基因CaMV35S、NPTIⅡI、NOS、CMV定性PCR检测方法。本标准适用于对青椒样品的转基因筛选检测，适用于抗黄瓜花叶病毒转基因青椒的鉴定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T1204植物及其加工品中转基因成分实时荧光PCR检测方法3术语、定义和缩略语
下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3.1术语和定义
转基因transgene
将本物种不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导入手段，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。3.1.2
聚合酶链反应polymerasechainreaction，PCR模板基因序列先经过高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别于模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核糖核苷酸（dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段呈几何倍数扩增，3.2缩略语
rbcLribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因，由植物叶绿体基因组编码。3.2.2
CaMV35S35promoterfromcauliflomermosaicvirus花椰菜花叶病毒35S启动子。
neomycinphosphotransferase-
新霉素-3\-磷酸转移酶。
nopalinesynthaseterminator
烟脂碱合成酶3转录终止子。
b
SN/T 2271—2009
CMVcucumbermosaicvirus
黄瓜花叶病毒。
样品经过提取DNA后，针对转基因植物所插入的外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增外源基因的DNA片段，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有该转基因成分，检测先对提取的DNA进行内对照的扩增，扩出相应的内对照条带后可以进行筛选基因的检测，如果筛选基因为阳性，再进行鉴定基因的检测。如果筛选基因为阴性则直接报告结果检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行5试剂
5.1PCR用引物
按照表1中提供的引物序列合成引物，加入无离子水配成100pmol/μL存，配成直接用于PCR反应的10pmol/μL的工作液。
表1转基因青椒PCR检测用的引物序列及PCR产物的大小引物名称
CaMV35S
5.2药品及试剂
引物序列
F 5'-aat ctt cta ctg gta cat gga c-3'R 5'-tca tca tct ttg gta aaa tca ag-3\F 5'-gct cct aca aat gcc atc a-3'R 5'-gat agt ggg att gtg cgt ca-3'F5'-gaa tcc tgt tgc cgg tct tg-3'R 5'-tta tcc tag ttt gcg cgc ta-3\F5*-acc tgt ccg gtg ccc tga atg aac tgc-3R5-gccatg atggatactttctcggcaggagc-3F 5'-aag acg ttg gca gct ggt cg-3R 5°-ctc gaa ttt gaa tgc gcg aa-3*片段/bp
内对照
TagDNA聚合酶，琼脂糖（电泳纯）溴化乙锭，三氯甲烷，异丙醇，70%乙醇，分子量标准（100bp~2000bp),RNaseA酶，Tris饱和酚UNG酶。TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)10×PCR缓冲液：100mmol/L氯化钾，160mmol/L硫酸铵［（NH,）2SO,J.20mmol/L硫酸镁(MgSO,).200mmol/LTris-HCl(pH8.8),1%TritonX-100,1mg/mLBSA。电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA+Tris-HCl(pH8.0）20mL加蒸馏水至1000mL；使用时10倍稀释。
溴化乙锭贮存液：用双蒸水配制成10mg/mL。dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTPCTAB提取缓冲液：1%CTAB,0.05mol/LTris-HCI（pH8.0），0.7mol/L氯化钠（NaCI），0.01 mol/L EDTA(pH8.0)。
6仪器
固体粉碎机或研钵，高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机，天平（感量0.001g）旋涡2
ht
SN/T 2271—2009
振荡器，PCR仪，电泳仪，超净工作台，核酸蛋白分析仪，微量移液器，凝胶成像系统，离心管（Eppendorf管，1.5mL~5mL），PCR反应管（200μL~500μL）。7检测方法
7.1样品DNA的提取与纯化
称取100mg样品至1.5mL离心管中，加人700uLCTAB提取缓冲液，涡旋振荡混匀后于65℃温育30min，期间颠倒混匀离心管2次～3次。加入700μL的等体积三氯甲烷：异戊醇，涡旋振荡混匀后放置10min，期间颠倒混匀离心管2次~3次；12000g离心5min。转移上清液至1.5mL离心管中。加入0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，于一20℃下静置5min，12000g离心5min，小心弃去上清液：加人1000μL70%乙醇，期间颠倒混匀离心管2次～3次，4℃下8000g离心1min，小心弃去上清液；加20μLRNaseA酶（10μg/mL），37℃温育30min。加人600μL氯化钠溶液，65℃温浴10min。加人600μL的三氯甲烷/Tris饱和酚，颠倒混勾后，12000g离心5min，转移上层水相至1.5mL离心管中。加人0.6倍体积经4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃下静置30min；4℃下12000g离心10min，小心弃去上清液；加入1000uL经4℃预冷的70%乙醇，期间颠倒混匀离心管2次～3次，4℃下12000g离心10min，小心弃去上清液；用经4℃预冷的70%乙醇按相同方法重复洗一次。冷冻干燥系统中挥干液体：加50uLTE缓冲液溶解DNA，4℃保存备用。7.2PCR扩增
7.2.1实验对照的设立
每个样品应有2个平行实验，同时每次检测应设立3个对照：分子量标准：
阳性对照，为包含要检测基因片段的转基因植物材料的DNA或包含要检测基因片段的阳性质粒DNA；
阴性对照，非转基因青椒基因组DNA；空白对照（不含DNA模板）。
7.2.2PCR反应体系
在200μLPCR反应管中，按表2所列顺序依次加人反应物，总体积为25uL。表2PCR反应体系组成成分
组成成分
10×PCR缓冲液
4XdNTP（2.5mmol/L.含dUTP）
引物1(10pmol/μL）
引物2（10pmol/μL）
TaqDNA聚合酶（5U/μL)
UNG酶(1 U/μL)
氯化镁（MgCl）（25mmol/L）
DNA模板
无离子水
7.2.3PCR反应程序
不同外源基因的具体扩增程序见表3。
25L反应体积
0. 5 μL~2. 0 μL(10 ng~50 ng DNA)使反应体积达到25μL
SN/T2271—2009
被扩增的外源
CaMV35S
94℃.3min
7.3PCR扩增产物的凝胶电泳检测表3PCR反应条件参数
54℃45s
72℃.45s
循环次数
最终延伸
72℃.7min
称取2.0g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液（0.5XTBE）中，用微波炉加热溶解琼脂糖，冷却至55℃～60℃左右加人溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液（0.5×TBE）使液面刚刚没过凝胶。将8μL～10μLPCR扩增产物和2μL加样缓冲液混合，点样。每行胶孔中选一个胶孔，在其中加入DNA分子量标记以判断PCR扩增产物大小。电压大小一般控制在3V/cm～5V/cm，电泳时间约35min，或者根据溴酚蓝的移动位置来确定，电泳结果用凝胶成像仪记录并保存。
8结果判定
8.1判断提取的DNA质量
使用内参照引物rbcL扩增样品的DNA，如果阴性对照、样品和阳性对照的PCR产物都出现433bp的条带，则表明提取的样品DNA符合PCR反应的要求，可以用于外源基因检测；否则不能用于检测外源基因，应该重新提取样品DNA。8.2筛选基因的判定
使用筛选基因的引物CaMV35S、NOS、NPTI对样品DNA进行PCR扩增，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带，则可以初步判断该样品含有外源基因，应该进一步进行确证实验，依照确证实验的结果最终报告。如果阴性对照和样品都未出现扩增的PCR产物.而阳性样品出现扩增的PCR产物，则可以判断待测样品中不含有该外源基因。8.3鉴定基因判定
对于青椒中转基因成分的检测，先检测CaMV35S、NOS、NPTⅡ基因。如果检测结果阴性则报告结果。
如果检测结果阳性，则进行鉴定检测CMV基因，以确定转基因青椒的为抗黄瓜花叶病毒的转基因青椒。
9确证实验
确证实验方法按照SN/T1204中规定的方法执行。书号：155066·2-19658
SN/T 2271-2009
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