【国家标准(GB)】 饲用纤维素酶活性的测定 滤纸法

ICS 65. 120
中华人民共和国国家标准
GB/T238812009
饲用纤维素酶活性的测定
滤纸法
Determination of feed cellulasc activity--Filter paper assay method
2009-05-26发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
全日业伴区
2009-10-01实施
本标准山全国饲料工业标推化技术委员会提出并归口，本标准起草单位：国家饲料质量蓝督检验中心（武汉）。本标准王要起草人：何凤琴、杨林、钱舫、刘小敏、屈利文、黄婷、额克亮httn：
wwufoodmate
GB/T 23881—2009
饲用纤维素酶活性的测定
滤纸法
本标推规定了以滤纸为底物，用还原糖比色法测定饲用红维素酶活性的方法。本标准适用于闻用纤维素酶活性的测定，定量检测限为0.02U/mL。2规范性引用文件
GB/T23881-2009
下列文件中的条款通过本标推的引用前成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标雅，然面，鼓励根据本标谁达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注口期的引用文件，其最新版木适用于本标准。GB/T6682分析实验用水舰格和试验方法GB/T14699.1罚料采样
GB/r20195动物饲料试样的制备
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标雄。3. 1
滤纸纤维素酶活性单位rilterpaper cellnlaseactivityunit在37℃，pH5.5，反应60min的条件下，每分钟降解滤纸释放1umol葡萄糖所需的酶量，定义为一个滤纸纤维素酶活性单位,以U表示。.4原理
纤维素酶水解滤纸产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5二硝基水杨酸还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm被长处有最大吸收，在一定范围内酶解产牛的还原糖的量与反应液的吸光值成正比。
5试剂和材料
本标推使用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。5.1酒有酸钾钠(C,H,KNa· 4H,O)。5.2苯酚。
5.3亚硫酸钠。
5.4氢氧化钠溶液（200g/L).称取氢氧化钠20.0g，加100ml.水溶解。5.5柠檬酸溶液(0.1n1o1/L)：称取柠酸(C,H。O，·Hz0)2.10 g，加水溶解定容牵100 mL。5.6柠檬酸钠溶液（0.1mo1/L)：称圾柠檬酸钠（Na,C,H0，·2H.0)2.94g，加水溶解定容至100 tmL.
5.7柠檬酸盐缓冲液(0.05mu1/L，1H5.5)：称取柠檬酸（CI1gO，II20)10.5g，加人氢氧化钠5,0多，再加800ml.水溶解，用柠檬酸溶液（5.5）或柠檬酸钠溶液（5.5）调节pH至5.5，再用水定容至1 000 mL.
GB/T23881—2009
5.8Whatman1号滤纸条(1.0cn×6.0em)5.9DNS试剂：称圾3，5-二磷基水杨酸3.15g，加水500ml.搅拌溶解，水浴至45℃.然后逐步加入氢氧化钠溶液（5.4)100mL，同时不断搅拌，直至光全解，再逐步加人酒石酸钾钠（5.1）91.0g、苯酚(5.2)2.50g和亚硫酸钠(5.3)2.50g，搅拌至溶解，冷却到案温后，定容至1000mL。过，取滤液存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放？d后可以使用有效期为6个月。警告：处理酸碱和配制DNS试剂时，应在通风橱或通风良好的房间进行，戴上保护眼镜和乳胶手套，一旦皮肤或眼睛接触了上述物质，及时用大量的水冲洗5.10葡葡糖标准溶液（10.0mg/ml.）称取经105℃烘至忆量的无水葡萄糖约1g，精确至0.0001g，加柠酸盐缓冲溶液（5.7)溶解，定容至100mL。6仪器与设备
除常用实验室设备外，其他仪器设备如下。6.1分样筛：孔径为0.25mm(60月）。6.2分析天平：感量为0.0001g
6.3pH计：精确至0.01。
6.4磁力搅拌器：附加热功能。
6.5电磁振荡器。
6.6离心机。
6.7忆温水浴锅。
6.8秒表，
6.9分光光度计。
6.10移液器：精度为1μL
7试样的制备
按（3/T14699.1采样，按GB/T20195选取样品全少500g，四分法缩减至100g.磨碎，通过0.25 mm乳筛，混勾密闭容器中,低温保存。8测定
8.1试样溶液的准备bzxZ.net
称取0.2g～4g试样，精确至0.0001，加40mL柠檬酸盐缓外液（5.7)，磁力搅拌30min，再用柠檬酸盐缓冲液（5.7）定容至100mL，在4℃条件下避光保存24h。播，取30mL～50ml，以3000t/rmin离心3min。取5.00mL上清液.用柠檬酸盐缓冰液（5.7)做一次稀释（稀释后的待测酶液中纤维素酶活性应控制在0.04U/mL~0.18U/mL之间）液体样品可以直接用柠檬酸盐缓冲液（5.7)进行稀释，定容（稀释后的酶液中纤维素酶活性应控制在0.U1U/mL~0.18U/mL之间)。如果稀释后的液pH偏离5.5,需重新调节pII为5.5,用柠檬酸盐缓冲液(5.7)稀释定容。
8.2标准曲线
8.2.1分别量取角萄糖标准溶液(5.10)0.00mL、2.00mL、3.00ml..1.00l、6.00mL、8.00ml、10.00mL，分别用柠檬酸盐缓冲溶液（5.7)定容至50mL，配成浓度为0.00mg/mL~2.00mg/ml.的葡葡糖标准系列。
8.2.2分别吸坡葡萄糖标准落液(8.2.1)条1.00mL于25mL容量瓶中，各所2.00nL水和2.00mlDNS试剂（5.9），沸水浴5min。冷却至室温，用水定容至25mL，在510nm波长下比色，以吸光度作横坐标，对应标雄葡萄糖液含糖的毫克数为纵坐标，列出直线回归方程。2
8.3酶活性的测定
8.3.1吸取10.0ml.经过适当稀释的酶液（8.1),37℃平衡10minGR/T 23881—2009
8.3.2在25mL其塞比色管中加人滤纸条（5.8），滤纸条须对称剪成32片并全部放入，加1.0mL柠檬酸盐缓冲液（5.7)浸润滤纸片，37C水浴平衡10tmin，再依次加人2.00mLDNS试剂（5.9），0.50ml.酶液（8.3.1)5L水，电磁振荡3g~5s,37℃水浴中保温60min（用秒表控制），然后在沸水浴中煮沸5min，冷却至室温，用水定容至25ml,在540rim波长处测定校准值A。8.3.3在25mL其寒比色管中加入滤纸条（5.8)：滤纸须对称剪成32片并全部放人，加1.0mL柠檬酸盐缓冲液（5.7)浸润滤纸片，37水浴平衡10mi，再依次加人0.50mL酶液（8.3.1），5ml水，电磁振荡3s~5s,37℃水浴中保温60min（用秒表控制），加2.00mLDNS试剂(5.9).然后在沸水浴中煮沸5tmin,冷却至室温，用水定容至25mL。在540nm波长处测定吸光度A19结果计算
9.1试样中滤纸纤维素酶活性以X表示，单位为酶活性单位每克（U/g），按式(1)计算：X=
X1000Xn
式(1)中：
X-…-—试样纤维素酶的活性，单位为嗨活性单位每克(U/g);根据标准曲线方程上计算得的(A,一A。)值对应的葡荐糖的质量，单位为毫克(mg)；M-
葡葡糖的摩尔质最，180.2g/mol；酶解反应时间，单位为分钟(min)；-转化因予,1 mmol=1 000 μrrol;试样的总稀释倍数。
9.2每个试样取两份试料进行平行试验，测定结果用其算术平均值表示，保留3位有效数字。10重复性
在重复性条件下的两次测定，所得结果的相对偏差不超过20%。合品伙伴网ht
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打印口期：2009年10月14日
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饲用纤维素酶活性的测定
滤纸法
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开本 88C×12301/16串张0.5字数 7下字2009年8月第版20C9年8月第--次印刷*
书号：155066：1-38469
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