【商检行业标准(SN)】 出入境口岸生物毒素检验规程 第2部分：金黄色葡萄球菌肠毒素B

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1763.2—2006
出入境口岸生物毒素检验规程
第2部分：金黄色葡萄球菌肠毒素BExamination codes for biological toxin at entry-exit port-Part 2: Staphylococcal enterotoxin B2006-04-25发布
华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2006-11-15实施
SN/T176山人境口岸生物雯悬检验规程共分为三个弃：第1部分：肉毒毒素；
第2部分：金黄色葡葡球茵肠毒素B：第3部分：鲍麻毒素
本部分是SN/T1763的第2部分
本部分录 A、附录 B,附录 C为为资料性附录。本部分由匡家认证认监督管理委员会提出并口。SN/T 1763. 2—2006
本部分由中华人民共和国广乐出人境检验检疫后负责起常，军事医学科学院微生物流行病研究所全牢微兰物检验码究中心参加起：本部分主要起草人：胡龙、达,郑玉玲、间剑勇、妾永强、正景林，本部分系苔次发布的山人培检验检疫行业标准。范围
出入境口岸生物毒素检验规程
第2部分：金黄色葡萄球菌肠毒素ESV/T 1763.2—2006
SN/T1763昀本部分现定了在出入境口毕对非椎床来源样品检验金黄延葡萄球菌畅毒素B的程序和方法：
本部分适用二在出人境口岸对可疑食品、水源和上壤及其他可疑污染物等非临床来源样品进行金黄色葡萄球菌肠毒素B实验室检验，不丁现场快速检验。2规范性引用文件
下列文件中的条款过过SN/T 1763的本部分的引用而成为本部分的系款，凡是注口期的引用文件,具随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或惨订版均不适片丁木部分，然而·鼓根据本部分达成函议的各为研究足否可使用这些义的最新版本。凡是不注H期的引用文件,其最新版本造用于本部分。
GE/T2789.1C—2003食品上生微生物学检验会黄色菊球菌检验GB108—2002实验空生物安全通用要求SN/T1763.！2006出人境口岸牛劾毒素检验规柱肉毒毒素WS2332062微牛物和生物医学实验索生物安全通用准则3术语和定义
SN/11763.1—2006确立的以及下列个语和定义适用于SN/11763的木部分：3.1
金黄色葡萄球菌肠毒素slaphylococcal enferoloxin,SE出金黄色葡萄球菌产生的蛋白质外市素，有SEA，SEB，SECSEID,SEE，SEF等多个血清型。4实验室生物安全要求
4.1实验室应按照GB=9.89—200%和WS233—2002对生物安全2裁（BSL2)实验室的兰物安全要求执行。动物试验时应按照GHB1948%2004对动物生物安全2级（AI3SI-2)实验案的主物安全要求执行。
4.2使用过的实验用品应按照GB315489一20G1刘废充物逃行无化处理。5检验对象
浚沐样品：
固体或半流动体样品；
地表面及物体衰面样品
草等植物样品。
6设备
Ⅱ级生物安全柜、高压蒸汽火菌器普通冰箱，普通台式离心机（密封的离心安全杯）、冷冻离心机SN/T 1763. 2—2006
（带密过的离心安全杯），普通忆温培养箱、忆溢水浴箱、酶标仪，洗板机、min:VII)AS、微呆振游器7样品制备
7.1食品样品的制备
安GB/1789.-02003中附录A。2的达提取食品户声素7.2非食品类液体样品的制备
可直接离心_0 min,取上清液各用。7.3非食品类固体或半流体样品的制备尼 SN/T 1763, 1—2005 中 7. 2 的规定。7.4地表面及物体表面样品的制备见 SN/T 1763. 1—2906 中 7. 3 的规定。7.5草等植物样品的制备
SV/T 1763. 1—2006 中 7. 4 的规定。8检验程序
8.1对多来型样品检验时，均川选择双问琼脂扩散试验、反向微影乳胶凝集试验，数猫版崆接种试验作为初筛方法;对食品类样品检验时，还叫选择VIDASSET2快速检验作为初筛检验方法。8.2对各类型样品进行检验时，可选择ELISA定性或定量试验作为确认方法。8.3进行ELISA定性或定量试验时，宜准备式两分上清液，1份不稀释直接试验，1分剂生埋盐水以体积比(如1：50)稀释「清液后再试验，如木经稀释的「清液试验综果为和，可不稀释「清液，停止试验：
8.4对样本行初筑试验后，尤诊齐方法结果是否一致，均应迹行至少一种确认检验。8.5确认试验结果是最终判结果的依据。9初筛试验
9.1双向琼脂扩散法
按照GB/T4789.-0-—2003附录A.4.3十对SEB的检验要求迹行9.2反向被动乳胶凝集试验
鑫沈附录 A。
9.3幼猫腹腔接种试验
参谢录 B
9.4VIDAS SET2快速检验
参见附录C。
10确认试验
10,1ELISA定性试验
接GB/T1789.1C—2003附求A.4.1对SEB的检验要求进行.10. 2 ELISA 定量试验
10.2.1试验材料
苯乙烯96 孔嗨标板或嗨标条，5℃ μL、100uL移液器，小姚杯50 mL,坂璃直径大于等于5 mm试管10 mL~25 nL,刻度坡管 5 mL、10 L和量简 100 mL10.2.2试剂
10.2,2.1碳酸钠（NsxCO）、碳酸氢钠（NaHICO）、磷酸一氢钾（KIIFO.）、磷酸氢二钠2
$N/T 1763.2—2006
(NαzHPO12H,O)、氯化钠(NaCI)、氯化钾（KCI),让温-20(Twc:n-20）、二血清白蛋白(ISA)浓梳酸(98必)和四氨基联苯胺(TMR)，[:述试剂均为分析纯，存放一常温通风T燥处。SFB抗原,抗SFR羊、兔IgG抗体,HRP标记抗 SEB多抗：HRP标记羊抗免IgG抗体，阳性对照（孟组 SEB抗原，淤度为1.0 ng/rrL）、阴性对照(PBS溶液,0.01 =nol/Ll17.2)均—2c保存。10.2.2.20.85%生理盐水,pH6.5、0.15 mol/l.PBS缓冲液，包被缓冲液,洗涤缓冲液,封闭液，终止液,A,B底物反液等溶凌配制见SN/ 1763.12096附录 A10.2.3操作步骤
10.2.3.1标准品溶液的配制：用0.85%生理盐水将肠毒素标准品稀释、在1ng/rmL~40ng/mL范国内选取(5~7)个浓度。
10.2.3.2包被：用包被缓冲液将抗S13羊多克隆抗稀释至抗体含量为g/ml.10μg/ml.：在酶标板的反应孔中加Iμl.,4C过俊。10.2.3.3洗瓷：弃L孔内溶液，用洗涤缓行液清洗3次，拍下。10,2.3.4封闭：旬孔加人2C uL封闭液，37℃、30111i1=.弃封闭液，五复步骤1C.2.3,3洗涤。10.2.3.5加样：将待检样加人酶标极，衔孔109，设同体疾阴性对照和性对照孔，吋做空白孔，每个稀释孔均设平行孔,37℃孵育1h。重复步骤1C.2.3. 3洗涤。10.2.3.6加嗨标抗体：于各反成孔中剂I人新鲜稀释的HRP标记的SEB羊抗免IgG抗体（经滴定后的稀释度)100！L，37℃浮竹1h，重复骤10.2.3.3洗。10.2.3.7加底物凌显色：于各反应孔中加人A,B底物使用液各一滴.37℃、10mizr.10.2.3.8终止反应于各反应孔中加人50μL.2mol/L硫酸，终止反应3min，阅定A15crm值，10.2.4结果判定与计算
10.2.4.1用酶标仪检验样品的Am件值。以空白对照孔调零后测量，标油葡菊球菌毒素和待检样品的实际A或值应扣除明性对照的A品值。以标准品的肠毒素含量和对成的吸光度值进行直线同内，得直线回内方程。将待检栏的吸光度值代入回归方程，即得待检样肠毒素的含量。10,2.4.2对一式两份的1清液逃流验吋.妇果1份试验结采为[或2份试验结果均为引性,则可判定本试验结果为阳性。如果2份上清液的试验结果均为阴性，则可判定本试验结果为防性，10.2.5注意事项
10. 2. 5. 1 本试验检验的灵敏度为 1. 25 ng/mL10.2. 5.2毒素浓这与实际A1.值做线性回归,相关系数邓 r值应人于0. 9910.2.5.3可侵等效的试刻盒进行本试验，操作步骤和结果判定应按试剂盆说明书进行。11检验报告
确认试验结果是最终报告结尽的依泌。检验授告式参见SN/T1763.1一2096险录B。3
SN/T 1763. 2—2006
A.I试验材料
附录A
（资料性附录）
反向被动乳胶凝集试验
U型板，25μL移液幕，小烧杯50mL，玻璃棒直径人于等于5mm，试管10mL~25rrL，刻度吸管5 mL-0 m, 和量简 l mL.
A.2试剂
SFA、SFB、SFC、SRD抗原标准品,抗 SEA、SFB、SEC抗体乳胶悬液和乳胶刘照溶液(2C保存）,免t清。
A.3操作步骤
A.3.1海试剂平衡至室温，
A.3.2用稀释液（生理水)12稀辫样品。A.3.3加25μL缓冲释释液到A~E行的第列，加25L SEA,SEBSEC、SBD抗原标泽品到A-~D行的第一列，
A.3.4加25 uI.SE任一抗原标准品到F行的第一列。A.3.5 25 uI. SF待检样本到 A～E行的第三列。A.3.6将乳胶抗SFA~T)溶液和对照乳胶落液各白充分混勾，并分剂训到对应的己训样的A~D行和E行
A.3.7游被条放到微量混勾器小心搭勾15$·避免泻洒：A.3.8将板条静置 21 h后灯断结果，A.4结果判定
A.4.1观察对照组结果：第-列各孔为阴性对照，应无避集。A~D行的第二列应有避集，为阳性对照，正行的第一列为性对照，如果以」对照组结果正常，则可以解释样本结果：A,4.2如果右 1 个以上血清型出现凝集,应送一沙做 EIISA定量检查。A,4. 3如果栏本中在 SEA,SF,SE孔同时出现阳性反应,可能是样本中含蛋白 A,应按照 A.4. 2操作。
A,4, 4将免i清卵入可疑样本巾。37℃浮育 30 i11。离心二5=nin(1 C00×g）,取1:清液，重复送行A.4.1各步骤，判脚凝集反应。
A.5注意事项
可使用等效的试剂盒迎行本试驱，操作步骤和结果判定成按试剂盒说明书进行，B.1试验材料
附录Ｈ
（资料性附录）
幼猫腹腔接种试验
SN/T 1763.2—2006
饮性注射1 rL、5 mL，刻度吸管 5 rL、10 nL,试管 15 rL～25 mL,窝心管59 mL，小烧杯50 mL,量筒 =0C mL,镊了,剪乃,漏斗纸,棉拭了,平而,接积坏、研钛和 pII 试纸等，体重 35C g~609g的幼猎：淮雄均可，年龄不限。B.2操作步骤
将丝100C水浴3i=热处理的标本，腹腔注射十幼猫（35g~60cg)，每只2rL~mL。B.3结果判定
在30 min到5 h内发生呕、腹泻者为阳性。只有泻没有叹吐者为川反应，注射后不到30 min即发生收性,并于1d内死:者为葡萄球菌溶血离术彻岸破坏而引起的反成。如发生以上情：宜延长上清液的加热时间，可达30 min,然斥重复试验。B.4注意事项
试验用猫应光观察「以上，尤吐腹泻者方可月丁试验。并丁试验前2h经喂食后选泽食欲和健康情咒良好的幼猫使用。
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C.1试验材料
附录℃
（资料性附录）
食品样品中SEB的VIDASSEI2快速检验方法均质器或菌乳体，肉心管50 mL，注射器2℃ mL,火菌吸管：1 mL.2 mL、1 mL，火菌销形瓶：10) ml.,电子天乎（0 g~100 .精确至 0.clg）、火菌刀，剪子，镊子、9.ml~1 ml.移液器、miniVIDAS.滤纸pH试纸
C.2试剂和溶液
VIDASSIT2试剂盒，方菌蒸编水，缓冲液（将VII)ASST2试剂盒提供的浓缩缓冲以尤南蒸馈水按1：18稀释）、5moL/L盐酸、1mol/L氯瓦化纳、三氯乙酸、TRISC.2.1试剂盒内容物
C,2.1.1试剂盒组成
30个SFT2相容器（已用鼠抗葡葡球噬毒素苣克隆抗体包被），标准液L纯化的SEA～1 I/rL，含 1 /L叠氮钙和蛋白稳定剂=·阳:性对照（纯化的SEA<1 n/mL，含 1 /L氮钠和蛋白稳定剂一),阴性对照(Tris-NaCl 15c mro./L-Tween pH 7.6+1 g/L叠氮钠)_,浓缩的提取缓冲液(1x55mL,2.5mol/LTris1Gg/LTwcenl0g/LMITpII8.0),MIE卡。C.2. 1.2试剂条组成
第1引为样本引,需加G0μl食品提取液.第2孔为前跳涤液(4c0 ml)Trisl150 mol/）Tween pH7. 6-小牛 血清-1 8/L 叠氮钠. 第 3,4、5、7、8、9 孔 为洗涤 液（600 L） Tris-NaCl(15G mmol/I)-『wec: p[I7.1【/I菩氮钠,第 E孔为姆结个物(0.不 ml.)含有 1 /I,凳氮钠的碱性酸酶标记的抗葡葡球菌肠毒素多克和单克降抗体，第IG孔为含底物（).3tI.)的小比怀：酸甲基伞形物(0.6 mmol/1.)[二Z醇氨(I正A)(0, 62 mol/1. 或6.6%-pH9.2) 11 g/1. 叠氮钠,C.3试剂保存
C.3.1VIDAS试剂盒存于2℃-8℃。划勿冷冻试剂。术用的试剂成放同2℃8℃C3.2打升试剂盒后.检查包装袋是否破,如破裂则个要使用。C.3.3为使试剂条保持稳定，从包装袋内取出后应使用封条封好包装袋并放回2℃～8。C.3.4如果按照以上程保存，试剂在有效期内稳烂，C.4样品制备
C.4.1提取缓冲液
将战剂盒内提供的浓缔提取液以无菌蒸镭水都释至混勺，2～多保柠存可停用3个月。也可根据使用的频率配置所需体积的缓冲液（稀释比=1：18)-C.4.2一般提取方法
取25g（ml）栏品中加人25ml.缓冲液，用均质器或无菌乳钵制成均匀悬液。18℃:~25℃静置15 tnin,将悬液于18℃~25完（10×g~～-3 000×)离心15 m,并将：清液用浸湿的稀花压出，检查溶液pH值。使用1mmnl/I.氢氧化钠调整滤液pH至7.5~8.0之间，符底。C.4.3液体食品
$N/T 1763. 2—2006
吸取25rnL详品，检查pH值.使用 1 I1Inol/L氧氢化钠话垫液体pH慎个 7.5~-8. 之问：如有沉凝，按照月.2逊行离心避滤。C.4.4脱水食品
称取25样，加人等量蒸馏水使食品水化，空温效置1h，称取水化食品25加入提取级冲液25 rmL，如 C.4.2方法进行提取C.4.5罐装食品
称取有代表烂的样品 25 g,加人25 ml.缓冲被，如（. 4.2方法进行提取：C.4.6生肉、海产品与熟肉样品
称取25是食品，近人25 .蒸馏水混勾，用均质器或无菌乳体制成均勾悬液。如悬液过，再血25mL蒸馅水漏匀.过滤，集个部滤液、使用5mmol/L盐酸调整pH到4.0.18%℃~25℃（3000×g~500c×g)离心15=nin将悬液于18℃~25℃以3000g~-5c00×离心15=nin.并将.F.薄液用浸泥的花过滤,检查滤液 pH 值,用 5 mr1ol/I. 氢氧化钠读整液体 pH 至 7. 5-~8. C 之间,如有沉淀,按照C..2方法逊行离心和过滤，收集滤液，待用。C.4.7奶制品处理
C.4.7.1不富集法
称取25g祥品，加人=0 mI.预温至38℃12C的蒸馏水，混勾，18℃～25静置30min,检查pII值,用5 1:nl/1.盐酸调整rH到.~2、0(若是牛奶样品，则占接称收25g样品或量取25ml.样品：使用 5 t:Im./T. HC1谢 pH值至 3. 5~4. C),将悬液于 8~~25℃(3 000×g~5 000×g)离心 15 rmit,收集清液，使用 1I-1I01/L氧瓦化钢调整[:清液的 =H 7. 5～8,0 之问：再将悬液于 18℃～25℃(30c0×g~5c00×g)离心15rmill:并将.1.清液用浸凝的花运滤.收集滤液.符用-C.4.7.2液体食品处理
使用 5 mol/1. 盐酸调整 25 ml.或25 食品的 pH 到 3. 5~~1. 0,用按照 C. 1. 7. 1 逊行处理C.4. 7. 3三氯乙酸(TCA)富集法a）推荐使用本方法，此方法可提高灵敏度、并可抑制某些生奶酪中可能出现的于就（如羊乳干酪等），按照（..7.1中程序至第一步离心结束，h
用收二清液并量取具体积V。
）上清液V)守加人定体积(Y)的TCA溶液（水辫液).得到终浓度为5为的落液：Y一Vx5/100.
混句,在 18℃:~-25℃静置 30 i1 使蛋亡沉淀e
f)布 18℃-25 3 00cxg~-5 0c0xg离心 30 in）奔掉上清澈。
h）在 (.3 nial/L 的 Tris(pH一0.8)落液它猝解蛋小球,所用 Tris 溶液的体积为上述上清体积的1/15，
使川 4 mo1/I氢氯化谢调整溶被的P至7.5-8.0 之间,在此下,乳液变为清澈。如有感浮颖粒, 18℃~25以 3 090×g~5 900×g离心15 minj）将二清液用浸湿的棉花过滤，收集滤液待用。C.4.8提取液的保存
应一提取后立即延有VILASSET2检验。除奶制品之外的其他食品的提取液可在一25℃士6℃储SN/T 1763. 2—2006
存了月，但个别情溉下信号会下降。C.5操作步骤
C.5.1开机-仪器迹行自检。
C.5.2冰箱取出所需试剂并使其恢复到空温（至少30 min)。C.5.3输人MLE卡信息
C.5.4每一个新剂盒在使用以前应苔先使用试剂盒中的MI,I 卡向仪器白动轮人或于动输人（VTT)AS或tntiti-VTD)AS)输人试剂规格（或山厂的校上线数据）。每：·盒试剂只需输入·次。C.5.5仪器校正
C.5.5.1在仪器中键人或选泽“SET2\以建立试验代码，C 5. 5.2用试剂盒内的校正液迹行校正,以所i每[1 d 过行一次校正。C.5.5.3校止液S1在向-饮测试中必须做双份,校止值必须在设定的RFV(树对荧光值)值之内。不则，应重新校正。
C.5. 6将 SET2 试剂条和 SFT2固相容器：装在 VII)AS相应的位置。该刘位置以确保回相容器上 3个学母继码的额色标记与试剂条粘符。C,5.7测定前将标准、对照和样今充分勾：准确吸取590L标准液和栏品提取液加人SLT2试剂条样孔中央。
C.5.8标准成以\SI\标记并微双份。如筛做阳性对照性对照,成分别以*C1”和\C2\标记。C.5.9操作VIDAS，仪器进行自动检验，一般70min可完成试验C.5.10测试完成后，从仪器凸取出试刻条和固相容器，所有用过的固相容器和试剂条经有效氯没池10 rrin后按照（194892004对发弃物要求处背C6结果与解释
C.6.1每一栏本的RFV值由VIDAS按以下公式计笠:检验值一样品RFV/标连RFVC.6.2值利缔缩果孵释
C.6.2.1检验阀值小 C.13,结果为阴性，人于等三 C.13结果为阳叫。C.6.2.2试验数值低二翊值下限表明样品不含有藿球菌肠毒素或毒素度低丁检验限。芒大丁(惑等于)「:限厕表朗样品含有葡荷球菌茵肠毒素，C 6,2.3今底数值超过预测哟分界值时，结果无效可用愿标本和相应的诚剂（标准利质控）新检验。
C.6.2.4如果所检验样品的试剂条没有做标准，结果亦为九效。叫用和向批号的SFT2试剂条做双份标准，结呆可以根据新存诺的标准重新计觉。C,6.2,5随机打印的报告内容包括试验类型、样本号、万期和时、试验盒批号及有效期、每个样品的RFV、检验值和相应结果的解释。C.6.2.6本试验最低检出浓度为「g/t:.C.7检验报告
根据试验结果填写检验报告（参见 SV/T1763.20C6附录B)。8
C. 8质量控制
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何批新的试剂盒百欲使用时为应用防性和序性对照进行检验，以证明试剂性能末受影响。有次校正时也应测定对照。阳性和阴性对照分别标以1和C2，仅器会自动认别。如果所测对照数值超过预期循，结果元效
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中华人天共和函人境检验检疫
行业标消
出入境口岸生物毒素检验规程
第2部分：金黄色葡萄球菌肠毒素BSN/T 1763.2—3006
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