【商检行业标准(SN)】 出入境口岸生物毒素检验规程 第1部分：肉毒毒素

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1763. 1—2006
出入境口岸生物毒素检验规程
第1部分：肉毒毒素
Examination codes for biological toxin at entry-exit port-Part 1:Botulism neurotoxin
2006-04-25发布
华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2006-11-15实施
SN/T176山人境口岸生物雯悬检验规程共分为三个弃：第1部分：肉毒毒素；
第2部分：金黄色葡葡球茵肠毒素B：第3部分：鲍麻毒素
本部分足SN/T1763的第1部分bzxZ.net
:本部分录 A 为规范性附录,附录 为资料性附录本部分由匡家认证认监督管理委员会提出并口。SV/T 1763.1—2006
本部分由中华人民共和国广乐出人境检验检疫后负责起常，军事医学科学院微生物流行病研究所全牢微兰物检验码究中心参加起：部分土要起草人：吕志平、达,吴烽、丁国允、康琳、端青、檀华,王景林、间剑勇。本部分系苔次发布的山人培检验检疫行业标准：１范围
出入境口岸生物毒素检验规程
第1部分：肉毒毒素
SV/T 1763.1—2006
SN/T1763的本部分规定「在出人境口岸对非临床米源栏品检验肉毒毒案的程序和方法。本部分适用二在出人境口岸对可疑食品、水源和上镶及其他可凝污染物等非临床束源样品逊行肉毒毒素检。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过SN/I 1763 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注口期的引用文件，其随后所有的修收单（不包括谢误的内容)或修订版均不适用丁本部分，然而，被励根据本部分达城协议的各方研究是否可使用这些文件的鼠新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GH/11789.【22003食品工生微生物学检验，肉毒梭菌及肉毒穿衰检验GB19289一200=实验些生物安伞通用要求WS233—2002微生场和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
个列术语和定义适用一SN/T1763的本部分，3.1
生物毒素hiolngicaltoxin
类出活的有机体如：微生物、动物、植物分泌或代谢产生的有特殊活性的并对其他生物物种有毒的物质。
肉毒毒素botulinum neurutoxin,BoNT厌氢条件下，山肉毒梭菌分泌的祥经毒叫外毒素，分为 BoNT/A～G共七型。4实验室生物安全要求
4.1实验室应按照GB=9289—200%和WS233—2002对生物安全2级（BSL2)实验室的兰物安全要求，动物实验讨应按照GB19289200=对动物准物安企2级（ABSL-2)实验空的准物安全安求4.2当进行可能产尘气溶胶或液休溅出的操作，或者可产生人毒素对，烩 4.1外，应同时按照G[3【948§—2001和WS233—2002户6.3.对13SI-3安全设备和个体防护的要求执行。4.3从事肉毒毒素检验工作的人员成接和肉毒类毒素疫苗。4.4使用过的实验用品应接照GB 19489—2004对废充物逃行尤害化处理,5检验对象
—浚沐样品；
一固体惑半动体样品
SN/T 1763. 1—2006
地表面及物体衣面样品：
草等植物样品。
6设备
工级生物安全柜、高乐蒸汽火菌器，普通冰箱，严通台式离心机（带密封的离心安全杯），冷冻离心机（带密封的离心安全杯），普迥忆溢培养箱、悔标仪洗板机，7样品制备
7.1液体样品
可取适量样品直接离心10 min(1000×g~3 00×g）,最上清液备用。7.2固体惑乎流动体样品
7.2.1在无菌密器巾对样品称量清将样品转移到无菌研轻：7.2.2如样品为装样品，则应首先用肥皂水擦试罐顶，水冲洗，去除过多的水，用70%酒精拭表面。
7.2.3研体中加适量（如等量,管量或5管量等）pH 6.5C.2%明胶磷酸盐缓冲液或生理盐水.浸范或研碎，1℃冷冻离心，直至上清凌完全澄清，收清液备用。7.3地衣面放物体衣面样品
将棉拭了捐人明胶磷酸盐缓沉凌浸湿，在地表而或物体表而均匀涂抹10 c1m人小的表面,然后再没人盛有10mL明磷骏盐缓冲液的试管，允分振荡，移人离心管，同前离心取上清液备尼。7.4草等植物样品
7.4.1用镊子取草叶1片20片（约2g)，绿草叶【0片（约2g)置清洁Ⅱ中，删入10ml.明胶磷酸熟缓冲液,用 1C tnl. 吸管充分冲洗草叶表面.移人离心,离心10 tnin(也可空温静置20 tniri)取「清液备用。
7. 51:述所有 1:消液均一式两份,1分直接接种动物 另 1分用盐龄调 p1 6.2~-6,5,按 9 ：1 的比例将样品与10胰嗨（活力1：250)水溶液勾，轻轻搅动。37℃作用1上后接种动物。8检验程序
8.1胶体金免疫层祈诚验利酶联见疫吸附试验是初筛试验，小自鼠腹腔注射试验为确认试验8.2应先进行两种初筛试验。如果两种初筛试验定性结果一致，可不进行确认试验；如果两种初筛试验结果为一阴一阳,应逊行确认试验。8.3确认试验结果是最终判定结果的依据9初筛试验
9.1胶体金免疫层析试验检验0VT/A本试验川二快速检验样品白有无 BoNT/A.9.1.1燥作步骤
用微量移液器或刻度吸管吸取120L妇后的样品液，加人检验卡的样品孔，5n1in后观测缩集，15rnin观察终止
9.1.2结果判定
9.1.2.1当控制线(C)山现紫红色沉淀线，而检验线（T)不出现紫红色沉淀线封为阴生，即尤[30V1/A检出。
9. 1.2.2当控制线(C)和检验线(T)均品现紫红色沉淀线时为阳性,表明样品巾含有 BcVT/A，9.1.2.3当控制线（C)和检验线（T)均不出现紫红色沉淀线，或只有检验线（T)出现紫红么沉淀线，表2
尔检验卡失效或实验失败。
9. 1.2.4其体判定模式见图1。
H）【沉凝线
9.1.3注意事项
观察窗
群品孔
b）两条沉淀线
图1检验卡结果判断示意图
9. 1. 3. 1 检验卡的检验灵敏度为 5 ng/ml.。SN/T 1763. 1—2006
）无沉淀线
9.1.3.2使用等效的试剂盒进行试验，操作步骤和结果判是应按试剂盒说听书进行。9. 2FI.ISA 双抗体夹心定性试验本试验用于在实验室检验群品中有无B:VT/A。9.2.1试验材料
聚苯乙烯96孔酶标板或酶标条-微量稳液器50L、00L小烧杯50mL，玻璃棒直径大于等于5 mm.试管 10 ml~-2 ml,刻度破管 5 ml,10 ml 和量倚 100 ml。9.2.2试剂
9.2.2. 1碳酸钠（NaCO、碳酸氢钠（NaHO,磁酸二氢钟（KHO1)，磷酸氢二（NazHPO,·12H,0)氯化钠(NaC1)、氛化钎（KCl),趾温-20(Tween-20),三血白蛋白（BSA）,浓硫酸（98)利I四氨基联苯胺（TMB），上述试剂均为分析纯.存放于常温通风十燥处。抗BoNT/A免多克降抗体,IIRP标记的抗 BoNT/A马而清多抗、性对照(BoNT/A 制剂，浓度 1. 0 ng/mL),阴性对照(PBS缓冲液，pII7.2)等均一25℃保存。9.2.2.20.85头生理盐水，p116.50.15mo1/1.P13缓沉液，包被缓冲液，洗涤缓冲液，封闭液，终止液：A、3底物反应液等溶液配制见附录A。9.2. 3 操作步骤
9. 2. 3. 1色被:将抗 BcNT/A 免多克降抗体用色被缓行液1 2 00 释释。在酶标板的反应孔巾加100 μL,2℃过夜或 37℃ 5 h.
9.2.3.2洗涤：弃孔内溶液，用洗疼缓冲液清洗3次拍干。9.2.3.3封闭：何司加人20CL封闭液.37℃孵育1h,弃封闭液，重复步骤9.2.3.2洗涤。9.2.3.4加样：加一定稀释的待检上清液10GL丁二述已包被之反应孔同时，以阴性对照和阳性对照试剂（：：19稀释)各100u1各设置【孔，并设牢白对照1孔,置37℃孵1h，重复步骤9.2.3.2洗涤。
9.2.3.5加酶标抗体:在反应孔中,人新鲜稀释的 HRP标记的抗 BoNT/A 马血清多抗(1：3 G00稀释)客100 L37℃孵香111,重复步骤9.2.3.2洗涤9.2.3.6加底物液显包：在各反应孔中分别加人AB底物使压液各50uL,37℃101mir.萨置避光，9.2.3.7终止反应：在各反应孔分别加人2 mo1/L硫酸50μL9.2. 4结果判定与计算
9.2.4.1肉眼占接观察：：亡免背景二，占接肉眼观察。反应孔内患色颜色越深,阳性程度越强，阴性反成为无色或极浅。
9.2.4.2用酶标仪、洗板机检验样品的412值，以空凹对照孔调零后测量.若人一期性对照均值的2.1倍.即为。
SN/T 1763. 1—2006
注意事项
9.2.5.1本试验的灵敏疫为0g/mT.-20退/m:T。待检样品成作平行孔。两孔间Aa50=值误差不成超过1C况：如超过10%，应重新进行本试验，9.2.5.2使用等效的试剂盒逃行尽试验，燥作步骤和结果判定应按试剂盒说明5迹行10确认试验
小广鼠腹腔注射试验为确认试验方法。设备、材料，试剂、方法利果判定分别按照GB4789.12—2003中第3.2利6.1的规定法11检验报告
11.1如果两利初筛试验均为阴性结果，可报告阴性结果，11.2如果两种初筛试验结果均为明性，可报告明性结果。11.3如果两种初筛诚验结果为-所,应以确认试验结果为最终结类,检验报告格式参见附录BA. 「 10%胰蛋白酶
胰蚤酶
蒸馏水
溶解后0.2过滤茶菌备用。
A.20.85%生理盐水
氯化钢(Natcl)
如至 Ico mL
溶解后高压火备用
附录Ａ
（规范性附录）
溶液配制
A. 3pH6. 5 0. 15 mol/IL, 磷酸盐(PRBS)缓冲液磷酸二氢钾磷酸氢一钠(NaIIPO12.0)
氯化钠（VaC1)
氯化伊(KCI)
燕馏水
1 CO nL
用盐酸凋pl1 幸 6,与,溶解后何瓶 109 rnL 分装,高压火菌备用，A,4pH6.50.2%明胶磷酸缓冲液
磷酸黏缓冲液
加至[C0 ml
用盐酸凋 pH 至 6. 5,加热辫解i每瓶 50 ml. 分装,高法火菌备用。A. 5包被缓冲液(pH 9,E 0, C5 imol/1.碳酸盐缓冲液碳酸钠(NaCo）
碳酸氢钠（NaIIC()）
加蒸馏水牟
100 =nl
SN/T 1763. 1—2006
用1rnol/L低化钠(Va011)阔lI牟,6溶解后衔瓶59 =nL分装,高压火菌备用，A,6洗涤缓冲液(pH7,4 0.15 mol/L, PBST)磷酸二氮钾(KIPO,)
磷酸氢二钠(Na.HPO：·12H,O)
氯化钠(Natl）
氯化钾(KCI)
0.05%Tweet-20
. 5 tnT.
用1ml/L氢氙化钠(VzaOH)调pH 7.=加蒸馅水1000 rn,溶解后包瓶 50ImL分装，高压灭菌备用。
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A.7封闭液
加洗涤缓冲液
济解后每瓶50ml分装
20℃保存备用。
A, 8 0.2 mol/L磷酸氢二钠(Na,HP()0.2 mol/L磷酸氢纳(NazIPO. _2II,)加蒸馏水
溶解后勾瓶50 ImL分歧压火菊备用A.90.1mol/I.柠檬酸
存檬酸·H,O
而蒸馏水至
溶解后每瓶50ImL分斐，压灭菌备用：A.10
0.1 mol/L EDTA
加蒸馏水至
用氛氧化钠（NaOI)调pII
100 mL
加热溶辩每瓶50mL.分装，高压灭菌备用。A. 11 A、B底物反应液
A 液:0.2 1ol/I. 磷酸氢二钠(Va2HP(O.)0.1mol/L柠檬较
30%双复水(）
加蒸密水 _0℃ inL,用盐酸调pH值 5, 0~-5, 4B液：TMB
加水乙醇（或DMSO）
0.「 mol/1.柠檬酸
0.1mol/LEDTA
加蒸馏水至
100 rL
51. 4 t:.
汁：A,3底物反应液均月棕色瓶避光殊行,使用 A,B液等体积加人。2终止液(2 mml/T. H,SO)
蒸馅水178.3n.1..逐滴加人98%的浓硫酸21.7ml.。6
送检单位
送检样品
送检样品包发性状
送样单位
送栏单位联系人，
联系电券
检验方法
初筛试验
确认浅验
检验人
单位或实验空（公章）
附录Ｒ
（资料性附录）
报告样例
检验报告
收样日期
送检群品量
送偿举位地址
梭验口期
签发人
SN/T 1763. 1—2006
检酸结果
SN/T 1763. 1-2006
中华人天共和函人境检验检疫
行业标消
出入境口岸生物毒素检验规程
第1部分：肉毒毒素
SN/T 1763. 1—3006
中国标版社非版
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刚号 www, hxchs, corn
定话：685239-668517548
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5学数15千学
2006个年8月第瓶2008年8月第改印划印数：2000
号：155C66-2-17023定价8.00元9002591/
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