【国家标准(GB)】 口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法

ICS 11. 220
中华人民共和国国家标准
GB/T22915--2008
口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法Protocol of universal fluorogenic RT-PCR for foot and moutl disease virus2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
CB/122915-2008
本标准参考了世界动物卫组裂（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽岛与案蜂）(第5版）。
本标准的附录A、附录C为规范性附录，附录R为资料性附录。本标准出中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口，本标雅起草单位：中华人民洪和国深班出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院，本标准主要起草人：花群义、杨云庆、秦智锋、周晓黎、卢体康、董俊、虹、阮周曦、叶奔优、林祥梅、昊绍强
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口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法本标准规定了口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测的操作方法本标准适用于动物及其动物产品中口蹄疫病毒的检测。缩略语
下列缔略语适用于本标灌：
荧光 RT-PCR
荧光反转录-聚合酶链反应bzxz.net
2Ct值
每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数。2.3.RNA
核糖核酸。
無磷酸磷酪
磷酸盐缓冲盐水，配力见附录A，2.6
Tag酶
TaqDNA聚合酶！
.2.7\ FMDV
口蹄疫病毒
3原理
CB/T 22915—2008
根据口蹄疫病毒各型共有的基因特定序列的保守片段，合成一对通用的特异证引物和一条通用的特异性探针，荧光探针的5'蹦标记FAM荧光素，3'端标记TAMRA袭北素，3端的率灭基团在近距离内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号。但在扩增时，由于Ta4酶的5'→3的外切活性，在延伸到荧光探针时，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生。四此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。
树料与试剂
4. 1 仪器与器材
4.1.1:荧光RT-PCR检测仪。
4.1.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。4.1.3.台式离心机（商心速度3000r/min）。4.1.4·灌句器。
: 4. 1, 5 冰箱(2 ℃～~8 %和-20 ℃两种),4.7.6：微量可调移微器（5uL,10μ，100，1000)及配套带滤芯吸头，:4. 1.7 .Eppendorf 管(1. 5 mL)、透明薄壁PCR 管(0. 2 mL)。业店
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CB/T 22915—2008
4.2试剂
4.2.1除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析统，所有试剂均用尤RNA污染的容器（用DEPC水处理片高压灭菌)分装。
4. 2. 2 三氟中烷。
4.2.3异丙醇：—20℃预冷。
4.2.4PBS:配制见附录A。
4.2.575%乙：用新升启的无水乙醇和DFPC水配制，--20C预羚。4. 2, 6引物: [引物 5’ TTACAAACCTAGCCIC-3'，下游引物 5'-CGGAGATCAACTTCECCIGTATG-3
爽光双标记探针(10μmQTS：(FAM)CIICCTTIGCGCCGTGG-3'(TAMRA)。4.2.71
口筛按疯龚通用炭光象
5抽样
5.1样工具
下列录样工其
棉拭子，
注射器。
5. 1. 6研
5.2样品采集
5.2.1 采集的样
即冷藏送检或置量
5.2.2水泡液及
无菌注射器穿刺水
无菌术剪下,放人含
T-PCR检测试剂盒：组成、功骼吸使用洋意项参见附录，成经慧21℃
兿是品腔、蹄
生素的PB
：用75次酒
深水泡液，
繁的PBS
5.2.3口腔分泌物教
喝找子，用
液，拭了并放人盛有
毒水池装皮，
含找素的PBS教的1.5ml
、口腔分泌物和织。采集后立
用求脂生理水繁去酒精，然后同中，水被采敏后，将水泡皮以
口腔内回前3次～次取分泌
取咽曦腋体，放人加有搅生
PBS。编号，冷藏送检或低温保藏：也可用食道探杯刮
5.2.4血液：用真空采血管戴注射器直接采取至无菌EPpcndo赠中，封、编号后保存了1C或送检。
5.2.5肌肉或组织班器：无菌来待检样品人咨植塑料我或其他火菌容器，继号，冷藏送检或低温保。
5.3样品照运
样品采集后，放人密闭的塑料装内（-个采样点的样品，放人一个塑料袋内），于保温箱中加冰、密封，送实验室。
5.4样品制备
5.4. 1水泡液.血液和口腔分泌物样品在混句器上充分混合后，用经高压火菌的锻子将拭了中的液体挤出，室温放骨80ni，戒上清筱转人无菌的1.5ml.Eppendorf管中，编号备用。5.4.2水泡皮、肌肉或组织脏器
墩待检样品2.0g于洁净、灭菌并烘一的研钵中充办研磨，加10mLPBS混旬，4℃下3000r/min离心I5min，取上清液转入无菌的1.5mLEppcndorf管中，缩号备用。2
品伙伴网http：//foodmate.5.5．样本存放
GB/T 229t5—2008
制备的样本在2℃~8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置70℃以下；但应避免反复冻融（冻翻不超过一次）
6·操作方法
6.1实验室标准化设置与管理要求：：口蹄斑病声荧光RT-PCR检测的实验室规范，见附录C6.2样本的处理
6.2.1在样本制备区进行，样品忠感RNA提取的试剂盒，有赖品化试剂盒出售，也叫自行配制。6.2.2，取n个灭菌的1.imlEppcndorf 管基为被检样品性对照与阴州对照的数量之和，编号。
6.2.3每管加人600
.个吸头,再加人200
6.2.4取与6.2.2
训，吸收6.2.3各
，混勾。
.6.2.5 于4C
去上清被；倒置
洗涤：
6.2. 6于4
分别加入被检样本，阴性对照、属性对服各200iL；一份样本换用烧，混匀器上振荡混勾
上清涩
000/mi
翼级上沾
20001/mi
太上清液，倒罩水纸上，沾十
6.2.7.以40量in离心10
体思到管底部割
小心測去汇清液
，室摄燥不能过于
6.2.8＇各管加度
用。提取的 RNA
6.3检测
6. 3. 1扩增试剂准鲁
在反应混合物配制
后;以2 000 r/min离心
(Eppcna
样品成在吸水
不同样品应在瑕水
RNA不溶
于 4. ℃,以2 000/min离心 15 mins：500：异醇（一20预冷），做标版取，杯能吸出中间层，颠倒
持期离心机转動方间放置），小心倒方沾干；加款60毫L75%乙醇，颠倒持朝离心机转辅力向放登），小心前浒干。
转轨方向旗置），静管壁上的残余液换用二个瞬头；骤实木要碰到有沉淀以2000或mi离心5s，冰1保存备
?0℃录箱，
从试剂盈中取出相应的荧光·RT-PG反应液、Tu酶;在室温下融化新沿光RI-PCR检测总数为
2为阳性对照数，1为阴性对爆数，获装配制反应体系混合液表 1配制度应体系混合液。
荧光 RT-PCR 反应应波(2×)
Tag酶
RT-PCR反转录颗粒
RVA酶抑制剂(RVasin)
ROX 态考染料(RUX reference dye)DEPC水
反应体系混合液分装
用量/L
1/2（颗）
+1)，其中u为被检样品数：
死管总用量/rL
×1/2(颗）
根据测试样品的数量（%），向配制的反应体系混合液中加人X1/2颗RT-PCR反转录酶颗粒，充3
Hklhttn://Fnodmatonn
GB/T 22915-2008
分混合均勾，按每个PCR暨40μL分装十0.2mL透明PCR管.将荧光PCR管放了95孔板上，一定要按顺序记录好被检样品管、圳性对照管、阴性对照管。转移至样本处理区。6.3.3加梯
在样本处理区进行。在各设定的 PCR 管中分别加入 6. 2. 8 中制备的 RNA溶液 10 μL,盖紧管盖,500 r/min离心30 s。转移至检测区，6. 3. 4荧光 RT-PCR 检测
6. 3. 4. 1 在检测区进行。将 6. 3. 3 中离心厝的 PCR 管放入荧光 RT-PCR 检测仪内,记录样本摆放顺序，在96孔板内（表内）记录或填写被检样品（Urknown），所虚对照（P净、阴整刘（NrC），设置探针:3*为 FAM,3'为 TAMRA,
6. 3.4. 2 循环条件设置,
第阶段，反转录42，30mins
第一阶段，预变性94℃,3 min;
第三阶段，91℃/10s，15℃/30s,72℃/1min5个循环；第四阶段，94℃/103.60℃/30s，40个循环，在第四阶段每个环的邀火延伸时收集炭光；试验检測结束后，根据收集的荧光曲线利Cr值判定结果，7结果判定
7.1结果分析案件设定
直接落取检测结果。萃线利網值设定原则根仪器噪声说进行调整，以阅值线刺好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。7.2质控标准
7.2.1阴性对照无C值，并H无扩增曲线，一直为水平线，7.2.2性对照的Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增此线，2个阻性对照扩增曲线基本重合。否则此次实验视为无效。
7.3结果描述及判定
7. 3. 1 阴性
无Ct值并无扩增曲线，表示样品中无口疫病萨。7.3.2阳性
Ct值小于等于30.0.且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在口蹄疫病毒。7.3.3有效原则
Ct值在30.0~38.0的样品建议重做。重做结累光Ct值者为阴性，否则为阳性。4
（规范性附聚）
试剂的配制
GB/T 22915-2008
0.2mal/L磷酸一氢钠水溶液：磷酸二氮钠（NaH,PUhH,0)27.6名，溶丁蒸馅水中，最后稀释室1 000 rL.
0.2uo1/L磷酸氢二钠水溶液:磷酸氢二钠（NaHPO,7II,O)53.6 g(或 NHPO.·12H,O71.6g，或NazHPO.·2H，035.6g）加蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL\0.0tmol/LPH7,2磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制A.3
取A液14mi,B液36mL,加氯化钠(NaC1)8:5g用蒸馏水稀释至10c心mL。经12.℃±2℃15min高压灭菌，冷却后，无菌条件下按每毫升加入1000IU青需素，1000g链霉素http：//foodmate.netGB/T 22915-~2008
B.1试剂盒组成
附录B
（资料性附录）
试剂盒的组成
每个试剂盒叫做48个检测，包括以下成分：裂解液
DEPC水
RT-PCR反应液（内含口蹄疫病毒的引物、探针）RT-PCR
阴性对照
阳性对照(非感染性体外转录 RNA)ROX参考染料(ROXreferencedye)R.2说明
30 mT,×1 盒
2 mLxI管
750 μL,X1管
2颗粒×12管
12μ×管
1mEXI管
2 ml,X1管
0.1mLxl管
B.2.1解液的主要成分为异氙酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色疫体：于4C保存，B.2.？DEPC水，是用1KDEPC处现后的去离子水，用于溶解RVA和稀释标准品：B.2.3RT-PCR反成中含有特异性引、探针及各种离子。B.3功能
试剂盒可用于动物组织样品（包括水泡皮、水泡液、组织、脏器、分泌物、趾液、血清或血浆等）中口蹄疫病毒的检测。
F.4使用时的注意事项
B.4.1在检测过程中，应严随不同样品间的交叉污染B，4.2反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应替是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。B,4. 3RT-PCR酶显粒极易吸潮失活,应在室温条件下置-下于燥器内保存,使用时取出所需数量,测余部分文即放回干燥器中。
nodmtonn
C. 1实验室设置要求
附录C
（规范性附蒙）
口蹄燈病毒荧光RT-PCR检测方法的实验室规范GB/T 22915—2008
C.1.1实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混合物配制区和检测区。（.1.2，工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。C.1.3每区域应右专用的仪器设备。C.1.4整个实验过程中均应使用无RNA.酶的-次性托材，用到的玻璃器血使用前应.250℃干烤4h以上，以彻底去除RNA酶。
C.1.5各区域的仪器设备应有明确标记，以避免备物品从各自的区域内移出；造贼不间的工作这域闻设备物品发生混谱。
C.1.6避入各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、护增反虚混合物配制区至检測区，
C.1.7在不问的工作区域应使用不同颤色或有明显区别标志的工作服，以便于监别，离并工作区时不得将客区特定的工作服带出。C.1.8“实验室清洁附应按样本制备区、扩增反应混合物配制区至检测区的顺序进行。.C.1.9·不同前实验区应有其资自的清范用具以防让交叉污染C.2工作区域仪器设备配置
C.2.1.样本制备区（要求在负压实验室或其有三级生物安全实验室内进行操作，BSI-3）样本制备区需配置以下仪器设备：2 ℃~.8 ℃冰箱;
20℃冰箱，
高速台式冷冻离心机(4七12000r/min）混匀器：
常录样器（0.2μ5μ10μL.20μ50μ100μ300μ1.000μ)；间移动紫外灯（近工作台面）。反应混合物配制区
反应混合物配制区需配置以下仪器设备：-2℃~8℃冰箱;
20℃冰箱：
手掌式离心机(3000/min），
混勾器：
微量加样器（0.5μ.2μ5102050μ100m、300μ1000）；可移动紫外灯（近工作台面）。C.2.3检测区
检测区需配置以下仪器设备：
荧光PCR仪(配计算机）；
移动紫外灯；
打印机。
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GB/T 22915-—2008
”C.3．各工作医撼功能及注意事项C，3.1样本制备区<要求在负压实验室或具有三级生物安全实验室内进行操作）本制备区的功能及注意事项如下：“：标本的保存，梭酸操取、贮存及其加人至行增反应管，变推本制备区进行。一一避免在本区内不必要的走数，可在本区内设京正压条性以避免邻近区的气溶胶进人本区造成污染。为避免样木间的交叉污染，加人待测核酸所，应立即盖紧会反应混合液的反应管，一用过的划样器吸头虚放人专门的消聋（例如含次氯酸钠溶滤）容器内。实验案桌摘志面每获！作后都要清洁，实验材料（原始样本，提取过程样本与试剂的混合液等）如出现外溅，应作清猎处现并作记录：
对实验台适当的紫外照谢（波长254nm，与工作合面近原离）有助火活去污染。下作后通移动紫外线灯管来砸保对实验面的充分脱射。C.3.2反应混合物配制区
反应混合物配制这功能及注意事项如下一试剂的分發和度应混合的制备本区进行。一一用下标本制备的试剂应百接运送案反应混合物配制区，不能经过检测区，在打开含有反应混合酸的离心管变敲管前，虚将其快遠离心数秒。在个本区的实验操作过程十，操作者应戴手套，并经觉更换。工作结束局应立即对工作区进行清洁，本工作区的实验台表面应可耐爱如鼠酸销等化学物质的消毒清洁作用，一一一实验台表面用可移动紫外灯（波长254）递行照射，.3.3检测区
检测区能及注意事项如下：
基固片段【病RNA或cDNA)的扩增&款增比段的分析在本区内讲行本区注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。为避免气溶胶所致的污染：应尽量诚少在本区内的想动：
完成操作及每天丁作后都应对实验室台间进行清洁和消册，紫外照射方法与前面区域相尚。如有落液溅出，应处理并作记录，本区的清造消毒和外照射方法同前面区域。C.3.4使用时的注意事项
在检测过程中，应严随不同样品的交叉污染：一反应液分装时避免产生气泡，上规前检查各反应管星否盖紧，以免荧光物质泄污染仪器。http://food
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