【国家标准(GB)】 痒病诊断技术

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 22910--2008
痒病诊断技术
Diagnostice techniques for scrapie2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
GB/T22910—2008
本标准是参照0IE《国际动物卫生法典》（2000年版）及《诊断试验和疫苗标准手册》（2000年版），以及美国农业部动物病研究所和瑞上的O1E传染性海绵状脑病参考实验室的有关规程和技术资料，结合我国农业郝动物检疫所的验证试验结果编制而成。本标准的谢录A、附录B、附录C为规范性附录。本标推由中华人民共和国农业部提出。本标准山全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标雅起肯单位：中国动物卫生与流行病学中心本标准主要起草人：王志亮、刘雨用、关镒三、吴晓东、于建敏、邹艳丽、下树双。http:
痒病诊断技术
木标准舰定了痒病临床诊断和实验室诊断的技术要求。本标准适用于缔羊和山羊的痒病诊断。2临床诊断
GB/T 22910—2008
.痒病临床症状各种各样，病程短则儿周，长则1年以，悠归死亡。患病母羊可发生流产。少数病例取急性经过，症状轻微，发病数日后突然死亡。病羊死后内脏常无肉眼可见的病变，当病羊出现以下全部或部分症状又不能确定为其他疾病时，应怀疑痒病的可能；行为异常
病初症状不易觉察；表现为耐力下降，然唇步态不稳并遂渐加重。时常欲侬水却饮得很少。此外，衰现为焦躁不安、怒惧、精补错乱；呈放击性或离样独处，呆立：旁，或操头竖耳、凝视，或高拾腿跑步初显症状3至4个月后，患羊感染加重而进一步消瘦行为异常逐渐加剧。瘊推
痒足摔病的重要临床症状。表现为头顶，臀部和尾部并始撤痒，甚至强烈摩擦；啃咬或用后歸摄抓身体率感处，致使头项、颜面、耳部、敦于体表和四肢皮肤脱毛、被损甚至斯聪。龙真胸部、胁部和后股被毛广泛悦落，人为摩擦病羊所部脊梁可诱导暗咬反应，或反射祥仲颈摇头，咬唇和舌头运动。感觉或反应过敏
“患羊反应过敏，对内音敏感，易受惊。有的病例的随意肌，特别是头、颈、胁腹和股部，皇现肌肉震颠，因人接近而兴态使震巅加再，安静时则震颤变轻，运动失调
运动失谢首先表现在转弯僵硬，后肢落地困难。随后，病羊端谢或倒地不起。体重和体说
患羊的休重和体况明显下降，并随着病程的发展而进一步恶化，最后消瘦而死亡3
实验室诊断
3.1组织病理学检查
3.1.1采样
临床症状可疑的率病病羊经注射麻醉药物致死后，按检术式取出全脑，包括大脑和完整脑干。3.1.2固定
将全脑和脑十直接效人10借～20倍脑体积的10%中性福尔马林液中渗透固定5d.换液后再维持一周。固定液配法见附录A。
3.1.3组织切片制作
3.1.3.1组织切块
脑组织横切8mm一5mm厚的组织块，选取以下部位组织作进步处理：脑尾制处延髓（闭合部与并张部），脑干的桥脑、中脑、丘脑及大脑纹状体，以上5块供检测用，保存其他部位备用。先切延髓，再切脑干：用新配制的固定液再固定一周，其间更换固定液3次。3.1.3.2.甲酸处理组织块
将固定的组织块放入流水中漂洗24h后，移人95%~98%中酸中作用2h，水洗2遍，每遍10min，1
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GB/T22910—2008
然后尊移人新配制的福尔马林溶液中保存至少24h，3. 1. 3. 3脱甲醛
将组织块放人流水中漂洗24h以上。3. 1. 3. 4 脱水
依次在以下佛度酒精中分别脱水：a）75%酒精中3h；
85%酒精中8h；
95%酒精1中3h
95酒精Ⅱ中3；
100%酒精1中3h;
100%酒精Ⅱ中2h。
3.1.3.5透明
依次在以下试剂中
）：二甲苯中2
3.1.3.6漫蜡
依次在以下试鑫
软嵯0
硬蜡」
硬蜡I（
3. 1. 3.7
将浸过赔的放入包捏福
后过夜修切战形,
3.1.3.8切片
将石蜻组织块
134-~138高厅
的载玻贴片，也可，
3.1.3.9烤片
r厚的
销薛15m
理的这
酷好织织薄片的载
以上。
3.1.3.10脱蜡和脱二甲苯Www.bzxZ.net
以细织
8)他埋，面下政平。放羚
-10 片，坳片硝屑和废年组织经织薄片干学购新附剂预处现造
筷自然条件下晾干,然后人45℃-~50的恒癌箱或烤箱中烘「4 h依次在二甲米和梯度酒精脱蜡去呷莱
甲苯T10trus
二甲苯10min:
100%酒精12min;
100头酒精Ⅱ2min；
95%酒精I2min;
9不酒精Ⅱ2min
85/酒精2min;
75%酒精2ming
白来水洗 2 min：
苏木素(II·E)染色
有关试剂配制见附录B。
http：
依次按以下程序染色：
）：苏木素染液15min；
白来水漂洗2min；
1%盐酸酒精10§;
自来水漂洗5nin；
饱和碳酸锂水溶液30s;
自米水漂洗10min
75%薇精2inin;
h）85%酒精2mim
i）.95%酒精价红液1m
3. 1. 5脱水、透明
依次处理的程序如
95%酒2
100%酒精A
100%酒糕
二甲苯
二甲新
3. 1. E封片
以适量中忆封，置38
3.1.7·贴签
用适当大
等记录在不干膜
3.1.8镜检及解定
3.1.8.1镜检
在光学显微媒
3.-1. 8. 2阳性结
二胶签贴
察切片，
御经纤
灰质区神经缅
着色或被伊红淡染，腰显，胞
大,成为“气球样”空滤
榄核、网状结构，桥脑的氧
的蘑砂端，然后用铅：
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号笔将切片的号、名称：实验时间呈规购的圆影或卵圆形，空泡内不经细随被逆个或多个特异性空泡胀压下
细胞。特别容易出现病变的部位有延髓敲迷走静经背核、舌下神经核、结构，中脑的红核、被盖核和丘脑肉诸核等处。这些部位的神经细胞出现特异的大空泡以及丘
数然体空泡病变，但呈双侧性分牵：和红核处也呵能有少量窄泡出，但不堂离侧对称，应注意区别。：：3.1.8.3阴性结果
灰质区无将征性空泡变性。
3.1.8.4确诊
在正常情况下，动眼神经核
组织病理学检查以是辫病确诊的辅助方法，逊行确诊时还应结含免疫组织化学方法或其他免疫学方法来进一步诊断。
3.2．免疫组织化学法检查
3.2.1试剂配制
见附录。
3.2.2来样
3.2.2.1.脑组织来样同3.1.1
活体采案第三眼脸淋巴组织的力法如下：在被检羊眼角滴加2%盐酸利多卡因局部麻醉后，3
合品伙伴网httn：
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用消毒的眼科器械翻转并固定第三眼脸，采集黏膜表层淋巴组织3.2.3固定
将剖检取出的全脑或活体采集的游巴组织，直接放人10倍～20倍组织体积的10%中性福尔马林罐液中渗透固定5d.换液片维拆一周：固定配法究附录A3.2.4操作方法
3.2.4.1每次免疫组织化学检查，都要设置阳性和阴性痒病组织切片作为免疫组织化学检测对照用。3. 2. 4. 2 组织切片制作法同 3. 1. 3。3.2.4.3白水中取出经脱、去二甲苯的划片，在磷酸盐缓冲液(P3S)中洗3次，每次5min3.2.4.4甲酸（98%）作用5nin，然后在PBS中洗3次，每次2nin（系处理商度感染组织特别需变的)
3.2. 4,5将蛋白酶缓冲液水裕加温至 37 C,按 5 rg/1rL加入蛋白酶K,立即放入切片确保切片全部浸人,消化 15 min。
3.7,4.6在一个不锈钢饭盒中倒人刚煮沸的蒸馏水,并立即将切片放人盒中确保切片完全禄人水中，盖好盒盖，在121C高正（约103kPa)处理20min：自然冷却至60℃以下收出。3. 2, 4. 7 在 PBS 中洗 3 次,奔次 5 uim3.2.4.8将切片光全浸人3%双氧水甲醇溶液中室温处理5min。3. 2. 4. 9在 PBS中洗 3次,年次 5 Iil1。3.2.4.10在切片的组织上滴满5片正常猪血清暨湿盆中室温作用20min，3.2.4.11奔去正常猪血清，用吸水纸吸于组织划片四周的液体。3.2.4.12.将抗Pr.F*核心片段单克降抗休（有商品）稀释为5ug/mL，滴加在组织切片工，确保组织完全覆盖,凝盒中 37 ℃作用4 h,或者在2 ℃~ ℃下作用过夜。3.2.4.13在PI35中洗3次，每次5min。3.2.4.14洗完后用破水纸瑕干组织切片四周的液体，然后有组织切片上滴加适量1.作浓度的生物素标记的抗鼠抗体（有商品），确保组织完全覆盖，湿盒案温作用10min。3. 2. 4、15在 Pl3s 中洗 3 饮,每次 5 niin,3.2.4.16洗完后用吸水纸吸十组织切片四周的液体，然后在组织切片上滴加适量1作浓度的亲和紊辣根过氧化物酶结合物（有商品），确保组织完全覆，湿盒中室温作用10min。3.2.4.17在PBS中洗3次，每次5min。3.2.4.18在蒸馏水中放置2mi
3.2.4.19洗完后用吸水纸吸于组织切片四周的液体，然后布组织切片上滴加适量工作浓度的AFC（3-氨基-9-z.基咔唑）底物显色液（有商品），确保组织先全覆盖，湿盒中宽温作用5min~10min。3.2.4.20用Mayer氏苏木索液复染脑组织1min，淋巴组织30s.3.2.4.21在蒸馏水中放置2min。3.2.4.22专用封片剂封片，
3.2.5结果判定
在光学显微镜下（倍数为10×10、10×20和10×40)观察切片，结果判定如下：a）阳性结果：在阳性和阴性对照片染色结果正确的条件下，组织切片灰质区（特别是脑门部的迷走神经背核、孤束核等处）或淋巴组织的生化中心出现特异性铁锈红色染色颗粒，则将该样品判为摔病阳性：
阴性结果：若组织切片灰质区（特别是脑门部的迷走神经背核，孤束核等处）或淋巴组织的化中心未见特异性铁锈红色染色颗粒，厕将该样品判为痒病阴性。上区
附·录
（规范性附录）
10%中性福尔马林固定液的配制
10%+性福尔马林固定液的配制：氯化钠
蒸馏水
40%甲醛
.100mt
把以上材料滋匀落解即可使用。http://v
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GB/T 22910—2008
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B.1 苏木素染色液
苏木精
无水艺
蒸馏水
钾明概
B.1.2配法
200 nL
附录B
（规范性附录）
组织病理学检查(H·E染色)试剂丽制光将苏木精溶了尤水乙醇，然后将钾明矾和蒸馏水煮沸溶化，去火并巡遂人苏木猜无水乙婷溶液中，立即加人氧化汞并煮沸，迅速冷却底加入冰乙酸过滤使用：B.21%盐酸酒精
在1cc m.的70%或80酒精中划人0. 5 ml.或1 ml.的浓盐酸，B.3碳酸锂饱和水溶液
在100 ml.的70%或80%酒精中加人0.5ml.或1ml,的浓盐酸B、4磁酸锂饱和水溶液
碳酸锂2名加100 mL蒸馏水，充分溶解。H.595%酒精伊红溶液
钳红0.5g加人100InL95%满精中淬化，6
http：
atoino
蛋白酶R缓冲溶液
Tris/HCl(1 mol/L,pH8,0)
CClz(U. 1 mol/1.)
加蒸馏水至
C.1.2配法
附录℃
(规范性附）
免疫组织化学检查的试剂配制
用前加蛋白醛K(1.4.7mg/mL)17μL使终涨度达5μg/mL。C2
3%双氧水-甲醇（使用前5min配制）甲醇
H202(30%)
C. 310×0. 1 mol/L. PBS(pI7. 4)Nacl
NagIIPO4
加求800mL溶解，调pH到7.4,加水至11.。使用时作10倍稀释。C.4·5%正常猪血清(NSS)
0.1 mol/L PBS (pH7. 4)
C.5Mayer氏苏术素液
C,5. 1 配方
苏木精
钾明斌
碘酸钠
水合氯醛
枸橡酸
蒸馏水
C.5.2配法
.1 000 mL
GB/T22910-—-2008
将苏木精、钾明矾及碘酸钠依次加入水中，略加热并搅拌，待全部溶解后过夜。再加入水合氮醛及枸酸并加热覆沸5min。冷却后过滤备用，如不急用可以不煮沸而在室温下特其成熟后使用，梁羧可以贮存较长时间。
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