【商检行业标准(SN)】 食品中大肠菌群和大肠杆菌快速计数法 PetrilfilmTM测试片法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1896—2007
食品中大肠菌群和大肠杆菌快速计数法PetrifilmTM测试片法
Rapid enumeration of coliforms and Escherichia coli in foods-PetrifilmTM coliform count plate andPetrifilmTME.coli/coliform countplatemethod2007-05-23发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
数码防伪
2007-12-01实施
SN/T1896—2007
本标准第一法修改采用了美国分析化学协会（AOAC)991.14官方方法《食品中大肠菌群和大肠杆菌PetrifilmTM测试片计数法》（AOAC?Of ficial MethodSM991.14:DryRehydratablefilmforenumerationof total coliformsandEscherichiacoliinfoods）；AOAC官方方法998.08肉、禽和海产品中大肠菌群PetrifilmTM测试片计数法（AOAC?OfficialMethodSM 998.08：DryRehydratableFilmMethodfor Enumeration Confirmed Escherichia coli in Poultry,Meats and Seafood)。本标准的附录A是规范性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局大连启元科技发展有限公司3M中国有限公司。本标准主要起草人：卢行安、施伟良、赵宏、张宏伟、郑文杰、刘中学、王金玲、吴刚、雷质文、刘冉、周振亚、陆苏。
本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。http：
1范围
食品中大肠菌群和大肠杆菌快速计数法PetrifilmTM测试片法
本标准规定了食品中大肠菌群和大肠杆菌的测定（PetrifilmTM1)测试片法）。SN/T1896—2007
本标准适用于食品和原料中大肠菌群和大肠杆菌的计数，也适用于表面的卫生检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN0169出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法3原理
3.1PetrifilmTM大肠菌群测试片（PetrifilmTMColiformCountPlate）是-种预先制备好的培养基系统含有VRB(VioletRedBile）培养基，冷水可溶性凝胶和氯化三苯四氮唑（TTC)指示剂，可增强菌落计数效果。表面覆盖的胶膜，可截留发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。培养结束后计数红点周围有气泡的菌落为大肠菌群数。
3.2PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测试片（PetrifilmTME.coli/ColiformCountPlate）是一种预先制备好的培养基系统，含有VRB培养基，冷水可溶性凝胶和葡萄糖苷酶指示剂，可增强菌落计数效果。绝大多数E.coli（约占97%）能产生β-葡萄糖苷酸酶与培养基中的指示剂反应，产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围。表面覆盖的胶膜，可截留发酵乳糖的大肠菌群产生的气体。培养结束后计数蓝点带气泡的菌落即为大肠杆菌数，红点带气泡和蓝点带气泡的菌落之和为大肠菌群数。4设备和材料
恒温培养箱：36℃±1℃。
4.2均质器（旋刀式或拍击式)或等效的设备。4.3pH计或精密pH试纸。
4.4PetrifilmTM测试片压板。
4.5放大镜或（和）菌落计数器或PetrifilmTM自动判读仪。5培养基和试剂
无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。5.21mol/L氢氧化钠（NaOH）：称取40g氢氧化钠（NaOH)溶于1000mL蒸馏水中。5.31mol/L盐酸（HCl）：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL。5.4PetrifilmTM大肠菌群测试片。5.5PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测试片。D）为美国3M公司产品的商品标志。ht
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第一法大肠菌群和大肠杆菌PetrifilmM测试片直接计数法6检验程序
检验程序见图1。
25g（mL）样品+225mL稀释液
10倍梯度稀释
只检测大肠菌群
接种1mL样品勾液到每张
PetrifilmIM大肠菌群测试片
36℃±1℃24h±2h
计数红色带气泡的菌落
报告大肠菌群数
检测大肠菌群、大肠杆菌或同时检测两项接种1m样品匀液到每张PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测试片
1℃24h±2h或48h±2h
+数蓝色带气泡的
报告大肠杆菌数
计数蓝色带气泡和
红色带气泡的菌落
报告大肠菌群数
图1PetrifilmM测试片直接计数法检测食品中大肠菌群和大肠杆菌数食品检测的操作步骤
7.1样品制备
制备的1：10
按照SN0169方法进行样品制备。品匀液无菌操作调节样品匀液的pH为6.5~7.5，酸性样液用1mol/L氢氧化钠（NaOH)调节，碱性样液用1mol/L盐酸（HCI)调节2）。7.2样品匀液的接种和培养
放10倍系列梯度稀释，根据样品的污染程度，选取适宜的2个～3个连7.2.1稀释：对上述样品匀液做
续稀释度，每个稀释度接种2张测试片7.2.2接种：将PetrifilmTM大肠菌群测试片或PetriilmTM大肠杆菌大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用吸管吸取1mL样液垂直滴加在测试片的串央，将上层膜缓慢盖下，避免气泡产生和上层膜直接落下，把压板（平面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养面积上。拿起压板，静置至少1min以使培养基凝固。7.2.3培养：将测试片的透明面朝上水平置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，培养温度为36℃土1℃大肠菌群检测时培养时间为24h土2h：大肠杆菌检测时，如果是肉，家禽和水产品培养时间为24h土2h，如果是其他产品，培养时间为48h土2h。8
表面检测的操作步骤
8.1培养基准备：用1mL无菌稀释液水化PetrifilmTM大肠菌群测试片或PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测试片。静置至少1h，使胶体（培养基）固化2）根据产品标准规定的酸碱溶液来调节pH值。2
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8.2表面采样：提起上层膜，使培养基部分置于待测物表面。用手指摩擦按压，保证膜与表面充分接触，然后将上层膜掀起，使之与物体表面分离，最后将其与下层合上。8.3培养：将测试片的透明面朝上水平置于培养箱内，堆叠片数不超过20片，培养温度为36℃土1℃。大肠菌群检测时培养时间为24h土2h，大肠杆菌检测时培养时间为48h土2h。9结果计算与报告
9.1判读
9.1.1目视、用菌落计数器放大镜或PetrifilmTM自动判读仪来计数。9.1.2在PetrifilmTM大肠菌群测试片上，红色有气泡的菌落确认为大肠菌群数。培养圆形面积边缘上及边缘以外的菌落不作计数。当培养区域出现大量气泡，大量不明显小菌落或培养区呈暗红色三种情况，表明大肠菌群的浓度较高，进一步稀释样品可获得准确的读数9.1.3在PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测试片上，蓝色有气泡的菌落确认为大肠杆菌。蓝色有气泡和红色有气泡的菌落数之和为大肠菌群数，培养圆形面积边缘上及边缘以外的菌落不做计数。出现大量气泡形成、不明显的小菌落，培养区呈蓝色或暗红时，进一步稀释样品可获得准确的读数。9.2菌落计数
选取目标菌落数在15～150之间的测试片计数菌落数，乘以相对应的稀释倍数报告之。如果所有稀释度测试片上的菌落数都小于15，则计数稀释度最低的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告之；如果所有稀释度的测试片上均无菌落生则以小于1乘以最低稀释倍数报告之如果最高稀释度的菌落数大于150个时，计数最高稀释度的测试片上的菌落数乘以稀释倍数报告之；计数菌落数大于150个的测试片时，可计数一个或两个具有代表性的方格内的菌落数，换算成单个方格内的菌落数后乘以20即为测试片上估算的菌落数（圆形生长面积为20cm）。食品中最终菌落浓度的单位以CFU/g（mL）表示，表面上菌落数以CFU/cm2表示，第二法大肠菌群和大肠杆菌Petrifrilm测试片MPN法10MPN法检验程序
检验程序见图2。
CmL）+225mL稀释液
10倍糍度稀释
选择3个适宜稀释度的样品匀液，吸取1mL匀液每个稀释度样品匀液各接种3张测试片36℃±1℃24h±2h或48h±2h
查MPN表
报告结果
直接计数bzxz.net
图2PetrifilmM测试片MPN法检验程序3
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11操作步骤
11.1样品制备
见7.1。
11.2样品匀液的接种
分别在做10倍递增稀释的同时，选择适宜的3个连续稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），吸取样品匀液，以1mL接种量加入到3张测试片（根据检测的目的采用PetrifilmTM大肠菌群测试片或PetrifilimTM大肠杆菌/大肠菌群测试片）。每个稀释度接种3张，接种方法见7.2.2。11.3培养
见7.2.3。
11.4判读
11.4.1大肠菌群判读
PetrifilmTM大肠菌群测试片上大肠菌群菌落的判读见9.1.2,PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测试片上大肠菌群菌落的判读见9.1.3。如果最低稀释度的3张测试片不都有大肠菌群菌落，可根据大肠菌群菌落的存在与否，对所有9张测试片进行阳性或阴性的定性判定，而无须计数每张测试片上大肠菌群菌落数目。
如果最低稀释度的3张测试片上均有大肠菌群菌落，可以按照上述的方法对每张测试片进行大肠菌群菌落定性判定，也可以采用测试片直接计数的方法，计算测试片上的大肠菌群菌落数目。11.4.2大肠杆菌判读
PetrifilmTM大肠杆菌/大肠菌群测试片上大肠杆菌菌落的判读见9.1.3。如果最低稀释度的3张测试片不都有大肠杆菌菌落，可根据大肠杆菌菌落的存在与否，对所有9张测试片进行阳性或阴性的定性判定，而无须计数每张测试片上大肠杆菌菌落数目。如果最低稀释度的3张测试片上均有大肠杆菌菌落，可以按照上述的方法对每张测试片进行大肠杆菌菌落定性报告，也可以采用测试片直接计数的方法，计算测试片上的大肠杆菌菌落数目。12结果报告
根据大肠菌群和（或）大肠杆菌菌落阳性测试片数，查MPN检索表（见附录A），报告每g（mL）样品中大肠菌群和（或）大肠杆菌的MPN值。如果可以直接计数的，结果报告见9.2。h
附录A
（规范性附录）
1g（mL）检样中最可能数（MPN）表SN/T1896—2007
1g（mL）检样中最可能数（MPN）表，见表A.1。使用九张测试片法，接种量（相当于样品的量）分别为0.1g(mL),0.01g（mL).0.001g(mL)。表A.11g(mL）检样中最可能数（MPN)表阳性测试片数
95%置信区间
http:
阳性测试片数
95%置信区间
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参考文献
1AOAC. Official Method 99o.14.Coliforms and Escherichia coli Counts in foods DryRehydratable Methods (Petrifilm E.coli Count Plate and Petrifilm Coliform Count Plate)Methods
[2JAOAC Official Method 998.08.Confirmed Escherichia coli Counts in Poultry, Meats andSeafood Dry Rehydratable Film Method Petrifilm E. coli/Coliform Count Plate Method.I3AOAC Official Method 989.1o.Bacterial and Coliform Counts in Dairy Products DryRehydratable Film Methods (Petrifilm Aerobic Count Plate and Petrifilm Coliform CountPlate?) Methods.
[4lAOACOfficial Method986.33.Bacterial and Coliform Counts inMilk Dry RehydratableFilmMethods (Petrifilm Aerobic Count Plate and Petrifilm Coliform Count Plate)Methods.[5]AOAC Official Method 2000.15.Rapid Enumeration of Coliform Counts in Foods DryRehydratable Film Methods Petrifilm Rapid Coliform Count Plate Method.L6]AOACOfficialMethod996.
Rehydratable FilmMethoe
Coliform
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ioIAssociationFrancaisede NormalisationCAFNOR
Plate Enumeration of
PetrifilmrM Coliform Count
Coliformcolonies.
Cetrificate No. : 3M 01/2-09/89. 3MTMTotal Coliforms Reading Gas Producing[111 NordVal Validation Ref.No.2005-30-5408-00045.Renewal of the NordVal certificate of 3MPetrifilmE.coli/Coliform CountPlate.L12]Korea Code of Federal Regulatory,KPDA 2o04:Dry RehydratableFilm Method-PetrifilmColiform Count Plate Method ((7.8.6.3).
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ht
SN/T18962007
[18J USDA FSIS. (Code of Federal Regulations) 9 CFR Part 310.25. Beef, swine, sheep, goats,horses, mules and other equine carcass sampling: Petrifilm E. coli/Count Plate; 9 CFR Part38l.94.Poultry, ducks, geese and guinea carcass sampling: Petrifilm E. coli/Count Platehtt
SN/T1896-2007
Foreword
The method one in this standard refers to AOAc Official Method sm 991.14:Dry Rehydratable filmfor enumeration of total coliforms and Escherichia coli in foods;AOAc Official Method sm 998.08:Dry Rehydratable Film Method for Enumeration Confirmed Escherichia coli in Poultry,Meats and Sea-food.
AnnexAof thisstandardisnormativeThis standard was proposed and is under the jurisdication of certification and Accreditation Adminis-tration of P. R. C.
The standard was drafted by Liaoning Entry-exit Export Inspection and Quarantine Bureau of P. R.China,Zhejiang Entry-exit Export Inspection and Quarantine Bureau of P.R.China,Tianjin Entry-exitExport Inspection and Quarantine Bureau of P.R,China,Inner Mongolia Entry-exit Export Inspectionand Quarantine Bureau of P.R. China,Shandong Entry-exit Export Inspection and Quarantine BureauofP.R.China,DalianNewEratechnologydevelopment Itd.,3MChinaLtd..The main drafers of this standard are Lu Xing-an,Shi Weiliang,Zhao Hong, Zhang Hongwei,ZhengWenjie,Liu Zhongxue,Wang Jinling,Wu Gang,Lei Zhiwen,Liu Ran,Zhou Zhenyaand Lu Subiao.This standard is a professional standard of entry-exit inspection and quarantine promulgated for thefirst time.
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SN/T1896—2007
RapidenumerationofcoliformsandEscherichiacoliin foods--PetrifilmTM coliform count plate methodandPetrifilmTME.coli/coliformcountplatemethod1Scope
This standard specifies the method for rapid enumeration of coliforms and Escherichia coil in foods(PetrifilmTMi)count platemethod).This standard is applicable to both the enumeration of total coliforms and Escherichia coli in foods orraw material and the sanitaryquantitative detection of surface.2
Normativereference
The following standard contains provisions which, through reference in this text, constitute provi-sions of this standard. For dated references, the subsequent amendments (besides the incorrect con-tent) or revisions are not applied to this standard. But the person who reach the agreement on thisstandard are encouraged to study if using the lastest edtion of these references. For undated refer-encesthelastesteditionofthepublicationreferredto applies.SN169Method for enamination of coliform,fecal coliform and Escherichia coli in food for export3Principle
3.1 PetrifilmTM Coliform Count Plate:The3M Petrifilm Coliform Count Plate isaready-to-use cuituremedium system which contains modified Violet Red Bile (VRB)nutrients, a cold-water-soluble gel-ling agent,and a tetrazolium indicator that facilitates colony enumeration The membrane on the platesurface can trap the gas produced by coliform lactose fermentation. After incubation the red colonieswith bubbles arecounted as coliforms.3.2PetrifilmTM E.coli/Coliform Count Plate:The 3MTM PetrifilmTM E.coli/Coliform Count（EC)Plate is a ready-made culture medium system which contains Violet Red Bile (VRB)nutrients,a cold-water-soluble gelling agent,an indicator of glucuronidase activity (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)(BClG),and a tetrazolium indicator that facilitates colony enumeration.The membraneon the plate surface can trap the gas produced by coliform lactose fermentation. After incubation theblue colonies with bubbles are counted as E.coli,red colonies with bubbles are counted as coli-forms.
1)Petrifilm isthetrademarkof3Mcompany.
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EguipmentandMaterial
Constant temperature incubator: 36℃ ±1℃.4.1
Homogenizer(revolving knive style or spanking style) or other equivalent.4.3pH meter or precisepH test paper.4.43M PetrifilmTM Plate and spreader.4.5 Magnifieror/and colony cou5 Medium and reagent (Supplement)5.1 Sterile saline solution: Weigh 8.5 g Nacl and dissolve into 1 000 ml distilled water, and thenautoclavefor15minat 121℃
5.21mol/LNaOH:Weigh40gNaOHand then dissolveit into000 ml distilled water.
5.3 1 mol/LHCl: Pipe 90ml HClandthendilute itinto1oooml distilledwater.5.4 PetrifilmTMColiformCountPlate.5.5-PetrifilmTME.coli/ColiformCountPlate.Method 1PetrifilmTM E.coli/Coliform Count Plate direct enumeration6Flow chart
The flow chart is showed in figure110
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